rs4379368基因突變?cè)诋屪迦似^痛中的價(jià)值及相關(guān)機(jī)制初探

吳小楊，黃艮彬，謝雯熙

偏頭痛是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為一側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性劇烈頭痛，呈反復(fù)發(fā)作，發(fā)作時(shí)還伴惡心、嘔吐、畏光及畏聲等，給病人及其家庭帶來(lái)不同程度負(fù)擔(dān)，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[1]。在我國(guó)偏頭痛患病率一般為9.3%[2]，而有關(guān)福建畬族人群流行病學(xué)調(diào)查顯示其偏頭痛患病率高達(dá)10.5%，考慮與其獨(dú)特生活方式、文化傳統(tǒng)及遺傳背景有關(guān)[3]。迄今為止，偏頭痛發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，大量研究均提示偏頭痛有明顯遺傳傾向及家族易感性，基因突變是其重要體現(xiàn)方式之一[4]。Anttila等[5]進(jìn)行了1項(xiàng)納入29種大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究的Meta分析，新發(fā)現(xiàn)了與偏頭痛相關(guān)的5個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)rs4379368、rs10504861、rs10915437、rs12134493和rs13208321。本研究前期已確認(rèn)rs4379368變異是福建畬族人群偏頭痛的遺傳風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物[6]，但對(duì)于其對(duì)畬族偏頭痛病人的影響及診斷價(jià)值尚不明確。本研究選取300例畬族偏頭痛病人和300名畬族正常人群作為研究對(duì)象，探討rs4379368基因突變對(duì)畬族偏頭痛病人的影響，并分析其診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取300例畬族偏頭痛病人作為病例組，入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)頭痛分類(lèi)委員會(huì)2004年制定的偏頭痛國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[7]，且由兩位副高級(jí)以上醫(yī)師確診；②病人及其父母親均為畬族人；③年齡≥15歲，能清晰描述自己癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并顱內(nèi)感染、腦出血、腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦腫瘤等神經(jīng)系統(tǒng)疾?。虎谄渌膊?dǎo)致的頭痛；③妊娠或哺乳期女性。同期選取年齡及性別與病例組匹配的300名畬族正常人群作為對(duì)照組，確認(rèn)無(wú)慢性頭痛病史及家族史。本研究所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，且已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 抽取所有研究對(duì)象3 mL外周血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管和分離膠促凝管中，前者充分混勻后直接保存用于rs4379368基因突變檢測(cè)；后者經(jīng)3 000 r/min離心10 min，收集上清并保存用于腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK)和磷酸化環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB)檢測(cè)。標(biāo)本保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 血清rs4379368基因突變檢測(cè) 采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)檢測(cè)rs4379368基因突變。第一，全基因組DNA提?。喝】鼓鈨龊蠹尤氲鞍酌窴，充分混勻，后參考說(shuō)明書(shū)完成全血基因組DNA提?。坏诙?，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。①設(shè)計(jì)并合成引物，正向引物：5′-AGTGGGCTTTCATTCTGGAA-3′；反向引物：5′-AAGGGCCTGAAATCTAATTCC-3′；②反應(yīng)體系20 μL，具體包括1 μL DNA模板、各0.5 μL正反向引物、12.5 μL混合物、5.5 μL 雙蒸水(ddH2O)；③擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下再延伸5 min；第三，PCR-RFLP：反應(yīng)體系20 μL，包括17 μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2 μL 10×Buffer和1 μL HphI限制性核酸內(nèi)切酶，于37 ℃溫浴1 h進(jìn)行酶切，后將產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并于凝膠成像儀上記錄酶切結(jié)果。根據(jù)酶切圖譜判斷個(gè)人基因型。

1.2.3 血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平；取出標(biāo)本解凍，參考各試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)；定性資料用構(gòu)成比(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)分析探討基因型與血清BDNF、TrkB、p-ERK 和p-CREB蛋白的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rs4379368位點(diǎn)PCR-RFLP結(jié)果分析 rs4379368位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為258 bp，經(jīng)HphI內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳分離后有2個(gè)等位基因C和T，3種基因型：CC型、CT型和TT型。詳見(jiàn)圖1。

圖1 rs4379368位點(diǎn)HphI內(nèi)切酶酶切電泳圖

2.2 兩組等位基因和基因型分析 應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組基因型分布發(fā)現(xiàn)，病例組(χ2=0.091，P>0.05)和對(duì)照組(χ2=0.143，P>0.05)符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)則；但兩組等位基因和基因型頻數(shù)分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組等位基因和基因型分析 單位：例

2.3 兩組血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，病例組血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平比較 (x±s)

2.4 rs4379368位點(diǎn)基因型與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，基因型TT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈正相關(guān)(P<0.05)，基因型CC與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，基因型CT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 rs4379368位點(diǎn)基因型與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白的關(guān)系

3 討 論

偏頭痛是一種臨床常見(jiàn)的慢性神經(jīng)血管性疾病，可發(fā)生于任何年齡，其患病率明顯上升，尤以年輕女性多見(jiàn)[8-9]。近年來(lái)，分子遺傳學(xué)發(fā)展迅速，成為偏頭痛發(fā)病機(jī)制的重要熱點(diǎn)之一[10]。本研究前期已確認(rèn)福建畬族偏頭痛病人存在rs4379368位點(diǎn)基因突變，但未進(jìn)行大數(shù)據(jù)驗(yàn)證。本研究收集福建300例畬族偏頭痛病人和300名畬族正常人群作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)兩者等位基因和基因型頻數(shù)分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中畬族偏頭痛病人等位基因T和基因型TT頻數(shù)分布明顯高于畬族正常人群，提示T等位基因有增加畬族人群患偏頭痛的風(fēng)險(xiǎn)，畬族正常人群罹患偏頭痛可能是等位基因C突變?yōu)榈任换騎所致，為畬族偏頭痛病人診療提供了一個(gè)新的突破點(diǎn)，是本研究重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)之一。

偏頭痛發(fā)病機(jī)制仍不明確，其中三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)被認(rèn)為是所有學(xué)說(shuō)的“頭領(lǐng)”，其將神經(jīng)、血管及遞質(zhì)三者完美結(jié)合，形象地解釋了偏頭痛的發(fā)病過(guò)程[11]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是神經(jīng)元生長(zhǎng)和存活所必需物質(zhì)，而B(niǎo)DNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族重要成員之一[12]。大部分研究均提示，BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛產(chǎn)生途徑中重要的神經(jīng)傳導(dǎo)因子，在多種不同形式痛覺(jué)中樞敏化過(guò)程中占有重要地位[13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，頭端前扣帶回皮質(zhì)(rostral anterior cingulate cortex，rACC)是調(diào)節(jié)慢性疼痛負(fù)性情感的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，與BDNF/TrkB信號(hào)通路密切相關(guān)，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)則是rACC中BDNF/TrkB介導(dǎo)信號(hào)通路的重要下游效應(yīng)器，有助于神經(jīng)性疼痛相關(guān)的惡性發(fā)展。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)BDNF和TrkB結(jié)合后可激活ERK信號(hào)通路，使ERK磷酸化，以進(jìn)一步活化cAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)，最終使BDNF水平升高，形成循環(huán)，參與神經(jīng)疼痛調(diào)節(jié)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，畬族偏頭痛病人血清BDNF、TrkB、p-ERK 和p-CREB蛋白水平明顯高于畬族正常人群，提示BDNF/TrkB相關(guān)信號(hào)通路在畬族偏頭痛發(fā)生過(guò)程中占有一定地位。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，基因型TT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈正相關(guān)，基因型CC則與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈負(fù)相關(guān)，基因型CT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB無(wú)相關(guān)性，提示基因型TT可激活BDNF/TrkB相關(guān)信號(hào)通路，參與偏頭痛發(fā)生，而基因型CC則可在一定程度上抑制BDNF/TrkB相關(guān)信號(hào)通路，阻止其向偏頭痛發(fā)展。

綜上所述，rs4379368位點(diǎn)等位基因及基因型在畬族偏頭痛病人和畬族正常人群中差異明顯，有一定鑒別診斷價(jià)值，其中基因型CC和基因型TT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB水平密切相關(guān)。