高濃度雌二醇對刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠急性自身免疫性肝炎的影響

張譯文，汪 黎，邱素藶，李秋陽，黎 哲，許成芳

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510630）

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH），是臨床上一種常見的肝臟疾病，主要是自身免疫攻擊引起的一種慢性進(jìn)行性肝炎，表現(xiàn)為肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥及淋巴細(xì)胞浸潤［1-2］。AIH 患者男女比例為1：8，且近年來部分臨床研究認(rèn)為女性妊娠期可能加重其自身免疫性肝炎的活動［3-4］。以往的研究認(rèn)為，女性和男性的免疫反應(yīng)不同，成年雌性比雄性表現(xiàn)出更強(qiáng)的先天性和適應(yīng)性的免疫反應(yīng)，這降低了女性罹患多數(shù)傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，但卻增加了女性患自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)［5］。一些臨床研究顯示，7%～21%的妊娠期患者和11%～86%的產(chǎn)后患者，高濃度的雌激素（estrogen，EE）狀態(tài)可能使其自身免疫性肝炎疾病活動度加重，但也有文獻(xiàn)報(bào)道妊娠期自身免疫性肝炎能夠得到部分緩解［6-9］。多項(xiàng)證據(jù)和臨床觀察清楚的表明雌激素在自身免疫性疾病中的重要作用，但其確切的觸發(fā)因素與發(fā)展的潛在機(jī)制尚未完全闡明［10］。既往研究［3-4］認(rèn)為AIH 是T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，雌激素已被證實(shí)可以促進(jìn)輔助性T 淋巴細(xì)胞（Th2）應(yīng)答，其可能通過影響細(xì)胞因子的分泌和雌激素受體的表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［4，11］。刀豆蛋白A 作為一種高效的有絲分裂原刺激物，通過小鼠尾靜脈注射，可以誘導(dǎo)急性自身免疫性肝炎，這一模型被廣泛應(yīng)用［12］。近年來有研究［13］發(fā)現(xiàn)，體外低濃度的雌激素和刀豆蛋白A 共同處理胸腺細(xì)胞可以明顯抑制胸腺細(xì)胞的增殖，緩解免疫性炎癥反應(yīng)；體內(nèi)研究［11，14-15］也發(fā)現(xiàn)外源給予低濃度的雌激素可減少INF-γ、IL-2、IL-4 等炎癥因子釋放，緩解刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的小鼠AIH。以往的研究表明，低濃度的雌激素可能通過抑制Th1/Th2 的活化，減少促炎因子釋放，緩解自身免疫性肝炎，但對于妊娠這一特殊時(shí)期，高濃度的雌激素對自身免疫性肝炎的影響并不明確。目前國內(nèi)外研究中，高濃度的雌激素對自身免疫性肝炎的影響鮮有報(bào)道，所以在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過建立刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的AIH 模型［12］，探索高濃度的雌激素對AIH 的影響并揭示其中可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng) SPF 級，C57BL/6，WT 雌鼠6 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司［許可證號：SYXK（粵）2020-0238］。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h 光照和12 h 黑暗條件，食物和水自由獲取。本研究所有動物實(shí)驗(yàn)操作程序獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗所實(shí)驗(yàn)動物中心倫理委員會機(jī)構(gòu)審批并通過。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 AML12 小鼠正常肝細(xì)胞系由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供；雌二醇購自美國Sigma 公司；刀豆蛋白購自美國Sigma 公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶測試盒，谷草轉(zhuǎn)氨酶測試盒均購自上?？迫A生物公司；DMSO 購自美國Sigma 公司，DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶和嘌呤霉素均購自美國Gibco 公司；ITS 液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑購自美國Sigma 公司，TNF-α，IL-6 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自江萊生物；TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本同仁；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自凱基生物。全自動生化分析儀購自日本HITACHI 公司；DM4000B 正置生物顯微鏡和照相系統(tǒng)購自德國Leica 公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，酶標(biāo)儀購自奧地利Sunrise公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AIH 小鼠模型的建立及分組 將20 只WT雌鼠按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組分組為：對照組（Control），刀豆蛋白A 組（ConA），雌二醇組（EE）和雌二醇+刀豆蛋白組（EE+ConA）。每組各5 只，共4 組。雌鼠卵巢去勢，將雌二醇溶于5%DMSO，按20 mg/kg（參照文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果），每天腹腔注射雌二醇，連續(xù)14 d，對照組腹腔注射等體積的5%DMSO［16-18］。最后一次腹腔注射雌二醇24 h 后，按12.5 mg/kg 劑量尾靜脈注射刀豆蛋白A［12］。各組在尾靜脈給藥24 h 后，地氟烷吸入麻醉，眼底靜脈叢取全血收集血清，處死小鼠，取肝組織經(jīng)液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AML12 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用含10 g/L 胎牛血清，1%ITS 的DMEM/F12 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng)AML12 細(xì)胞。置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，0.25%胰酶消化后傳代、鋪板。探究在AML12 中不同濃度雌二醇對AML12 活性的影響，各處理組分別加入不同濃度的雌二醇，5、10、15 和25 μmol/L，處理24、48 h，設(shè)立溶劑組0.1%DMSO和不做處理的空白對照組。

1.3 蘇木素-伊紅染色

將肝臟置于40 g/L 多聚甲醛固定24 h，梯度脫水后石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片（厚度4 μm）。常規(guī)蘇木素-伊紅（H&E）染色，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟炎性反應(yīng)程度。

1.4 TUNEL凋亡染色

將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用10%蛋白酶K修復(fù)組織，37 ℃恒溫箱孵育20 min，PBS 漂洗；0.1%Triton破膜，常溫孵育20 min，PBS漂洗；加buffer 置于室溫平衡10 min；切片放于濕盒內(nèi)，加入適量反應(yīng)液（TDT 酶，dUTP，buffer 按1：5：50 混合），37 ℃恒溫箱孵育2 h，濕盒內(nèi)加少量蒸餾水保持濕度。PBS 漂洗后，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min。PBS 漂洗后，抗熒光淬滅封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶測定

將采集的全血放置4 ℃，靜置過夜后，于4 ℃，1 000×g離心20 min，收集血清，采用全自動生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）和 谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）濃度。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

采用商品化酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測血清IL-6，TNF-α 的表達(dá)量。將血清用樣品稀釋液于冰上稀釋5 倍，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，空白孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加待測樣品50μL，空白孔加樣本稀釋液50 μL，2 個(gè)復(fù)孔/樣。向各孔中加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，于37 ℃恒溫箱孵育60 min，洗板5次，加入顯色底物100μL，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，每孔加入終止液50μL，在450 nm 波長處測定吸光度（optical density，OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品OD值代入方程，計(jì)算對應(yīng)濃度。

1.7 CCK8檢測雌二醇對AML12增殖能力的影響

AML12 細(xì)胞 以4 000 個(gè)/孔接種于96 孔板 中過夜，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入不同濃度的雌二醇5、10、15 和25μmol/L，0.1%DMSO 及完全培養(yǎng)基的對照組100 μL/孔，分別培養(yǎng)24、48 h，每孔加入10μL CCK8溶液，37 ℃恒溫箱孵育2 h后于酶標(biāo)儀450 nm處測量OD值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量

AML12 細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞數(shù)量長至60%～70%融合后，加入不同濃度的雌二醇5、10、15和25μmol/L，0.1%DMSO 及完全培養(yǎng)基的對照組2 mL/孔，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)處理分析。將上述各組細(xì)胞加入不含EDTA 胰酶消化后，PBS 洗滌細(xì)胞2 次（1 000×g，5 min），收集（1～5）×105個(gè)細(xì)胞，加入500μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL PI（碘化丙啶，Propidium Iodide）混勻，室溫，避光反應(yīng)5～15min，然后用BD流式細(xì)胞分析儀分析凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血清學(xué)，TUNEL 及ELISA 結(jié)果，當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時(shí)，采用二因素二水平析因設(shè)計(jì)的方差分析，并計(jì)算交互作用。CCK8 及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時(shí)，采用單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度的雌二醇可加重刀豆蛋白誘導(dǎo)的AIH

本研究通過H&E 染色觀察到：正常小鼠肝細(xì)胞正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索排列有序整齊；各模型組可見肝細(xì)胞腫脹，變性并伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤；與對照組相比，EE 組也出現(xiàn)少量的炎癥細(xì)胞，分布于界板周圍，但肝小葉結(jié)構(gòu)相對完整；與ConA 組相比，EE+ConA 組病理變化更為明顯，出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，分布于肝竇，界板周圍，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝臟損傷程度加重（圖1）。分別對各模型組小鼠血清中AST 與ALT含量進(jìn)行2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析，AST 結(jié)果顯示：ConA 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=194.76，P＜0.000 1）；EE 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=41.09，P＜0.000 1）；兩種處理存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=27.33，P＜0.000 1）。ALT 結(jié)果顯示：ConA 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=122.67，P＜0.000 1）；EE 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=32.02，P＜0.000 1）；兩種處理存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=17.10，P=0.00 1）。組間兩兩比較結(jié)果顯示，與Control 組相比，ConA 組給藥24 h 后，血清ALT 和AST 水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，［ALT：（36.32 ± 13.36）vs.（1 567.02 ± 526.91）U/L，P＝0.000 2；AST：（45.78 ± 8.47）vs.（2 363.08± 629.94）U/L，P＜0.000 1］。與Control 組相比，EE 組血清ALT 和AST 水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，［ALT：（36.32 ± 13.36）vs.（372.33 ± 87.25）U/L，P＝0.000 7；AST：（45.78 ± 8.47）vs.（359.81± 139.01）U/L，P＜0.000 1］。與ConA 組相比，EE+ConA 組血清ALT 和AST 水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，［ALT：（1 567.02 ± 526.91）vs.（3 727.34 ± 829.05） U/L，P＜0.000 1；AST：（2 363.08 ± 629.94）vs.（5 452.09 ± 996.58）U/L，P＜0.000 1；圖2］。

2.2 高濃度的雌二醇通過促進(jìn)凋亡加重刀豆蛋白A誘導(dǎo)的AIH

圖1 各組小鼠中肝臟炎癥反應(yīng)程度比較Fig.1 Comparison of inflammation in liver tissues of mice among each group

圖2 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT變化Fig.2 Serum AST and ALT of mice among each group

分別對各模型組TUNEL 陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示：ConA 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=608.81，P＜0.000 1）；EE 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=119.02，P＜0.000 1）；兩種處理存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=26.24，P=0.001）。組間兩兩比較顯示：與Control 組相比，ConA 組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（12.67±2.52vs.96.00±4.58，P＜0.000 1）；EE 組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（12.67±2.52vs.37.77±4.93，P＜0.000 1）。與ConA組相比，EE+ConA 組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增高，（96.00±4.58vs.164.33±12.90，P＜0.000 1；圖3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 各組小鼠肝細(xì)胞TUNEL陽性表達(dá)情況Fig.3 Positive expression of TUNEL in colon cells of mice in each group

2.3 高濃度的雌二醇增加血清中TNF-α和IL-6含量

通過ELISA 檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6 的含量，分別對各模型組TNF-α 和IL-6 的表達(dá)水平，進(jìn)行2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析，TNF-α結(jié)果顯示：ConA 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=339.54，P＜0.000 1）；EE 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=40.74，P＜0.000 1）；兩種處理存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=6.00，P=0.037）。IL-6 結(jié)果顯示：ConA 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=33.08，P＜0.000 1）；EE 處理的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=395.641，P＜0.000 1）；兩種處理存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=60.86，P＜0.000 1）。組間兩兩比較結(jié)果顯示，與Control 組相比，ConA 組TNF-α 表達(dá)明顯增高，［（22.16±6.27）vs.（85.92±7.12）pg/mL，P＜0.000 1］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Control 組相比，EE 組TNF-α 表達(dá)明顯增高，［（22.16±6.27）vs.（49.14±3.77）pg/mL，P=0.000 1］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與ConA 組相比，EE+ConA組TNF-α表達(dá)明顯增高，［（22.16±6.27）vs.（97.94±3.23）pg/mL，P=0.024 7］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠血清中IL-6 水平結(jié)果顯示，與Control 組相比，ConA 組IL-6 水平增高，［（3.31±0.48）vs.（4.05±0.89）pg/mL，P=0.18］，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EE組IL-6 水平增高，［（3.31±0.48）pg/mLvs.（13.34±0.52）pg/mL，P＜0.000 1］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EE+ConA 組IL-6 水平明顯增高，［（3.31±0.48）vs.（8.43±0.79）pg/mL，P＜0.000 1］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與ConA 組相比，EE+ConA 組IL-6 水平明顯增 高，［（22.16±6.27）vs.（97.94±3.23）pg/mL，P=0.024 7；圖4］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 高濃度雌二醇抑制AML12增殖活性

本實(shí)驗(yàn)采用CCK8 檢測AML12 細(xì)胞的活力，分別對各模型組采用單因素的方差分析，結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（24 h：F=6.11，P=0.000 5；48 h：F=118.61，P＜0.000 1）。采用LSD-t檢驗(yàn)，進(jìn)行組間兩兩比較結(jié)果顯示，與Control 組相比，0.1%DMSO 組處理24 h 對AML12 增殖活性無明顯影響，（1.03±0.17vs.1.01±0.15，P=0.783），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10 μmol/L EE 組處理24 h 可以明顯抑制AML12 增殖活性，（1.03±0.17vs.0.85±0.06，P=0.014 6），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Control 組相比，0.1%DMSO組處理48 h對AML12增殖活性無明顯影響，（1.02±0.09vs.1.08±0.07，P=0.074 4），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10 μmol/L EE 組處理48 h 可以明顯抑制AML12 增殖活性，（1.02±0.09vs.0.71±0.05，P＜0.000 1；圖5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 高濃度雌二醇體外可以促進(jìn)AML12細(xì)胞凋亡

圖4 高濃度的雌二醇增加血清中TNF-α和IL-6含量Fig.4 EE administration increased the levels of IL-1β and TNF-α in serum

流式細(xì)胞術(shù)是一種常見的檢測細(xì)胞凋亡的方法，利用Annexin V 及PI 雙染法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，可以直觀地了解細(xì)胞凋亡比例。分別對各模型組采用單因素的方差分析，結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=4.337，P=0.017 4）。采用LSD-t檢驗(yàn)，進(jìn)行組間兩兩比較結(jié)果顯示，與Control 組相比，10μmol/L EE 組處理24 h 可以促進(jìn)AML12 的凋亡，［（6.42±0.43）%vs.（18.11±5.79）%；圖6］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

圖5 CCK8檢測AML12細(xì)胞活力Fig.5 Analysis of cell viability of AML12 cells by cell counting kit-8

自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制可能是，抗原呈遞細(xì)胞（APC）將抗原肽提呈給未分化的輔助性T 細(xì)胞（Th0），根據(jù)免疫微環(huán)境中的不同細(xì)胞因子分化為Th1、Th2、Th17 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）等細(xì)胞，Th1 主要分泌TNF-α、IL-2 等，Th2 主要分泌IL-6、IL-4 和IL-10 等；在TGF-β 存在時(shí)，可以促進(jìn)Th0向Tregs 細(xì)胞分化，抑制免疫反應(yīng)過度激活［19］。研究表明自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展是由于自身免疫耐受機(jī)制受到破壞，在正常人中，這種免疫抑制作用主要由存在于外周循環(huán)中的FOXP3+、CD4+、CD25+Tregs完成；但在自身免疫性疾病患者中這種細(xì)胞的功能和數(shù)量卻存在爭議，兒童期發(fā)病患者的外周循環(huán)中的Tregs 數(shù)量和功能可能均受到抑制，但成年期發(fā)病患者外周循環(huán)中Tregs卻并未發(fā)現(xiàn)有明顯缺陷，相反在未經(jīng)治療的AIH 患者的肝臟中發(fā)現(xiàn)了Tregs 細(xì)胞累積［20］。目前，部分自身免疫性肝炎女性患者，妊娠期復(fù)發(fā)的原因不清，多以激素和免疫抑制劑等對癥治療［21］。妊娠期高濃度的雌激素濃度可抑制Th1/Th2和Th17/Tregs之間的平衡，增加FOXP3+、CD4+、CD25+Tregs 細(xì)胞的水平，增強(qiáng)免疫耐受，其可能通過激活雌激素受體，如經(jīng)典的細(xì)胞核受體ERα和ERβ，以及非經(jīng)典的膜受體G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER），影響不同細(xì)胞炎癥因子，如IL-6，TNFα 等的分泌［10，22-23］；也可能通過不同的雌激素代謝產(chǎn)物如2-羥基雌二醇和16-羥基雌二醇等影響肝臟的代謝反應(yīng)［5］。刀豆蛋白A是一種植物血凝素，能有效刺激T 細(xì)胞并迅速誘導(dǎo)其活化和組織浸潤［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過建立刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的AIH 模型，H&E 染色結(jié)果顯示，高濃度的雌激素不但能直接誘導(dǎo)免疫細(xì)胞激活和炎癥細(xì)胞浸潤，損傷肝臟；還可以加重刀豆蛋白誘導(dǎo)的AIH，使肝內(nèi)門管區(qū)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肝小葉內(nèi)部分肝細(xì)胞腫脹，變性，壞死。ELISA 結(jié)果提示，高濃度的雌激素可以直接促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌，這可能與雌激素直接影響Th1/Th2的分化相關(guān)［10-11］。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)分析內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率Fig.6 Analysis of AML12 cells′apoptosis rates with flow cytometry

以往的研究表明，低濃度的雌激素對肝細(xì)胞的活性無明顯影響。高濃度的雌激素可以在誘導(dǎo)Hela細(xì)胞死亡，并通過激活內(nèi)源性凋亡通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［10，24］，因此我們推測，高濃度的雌激素可能影響肝細(xì)胞的活性。本次實(shí)驗(yàn)中，我們通過建立不同濃度梯度的雌激素，體外培養(yǎng)AML12 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高濃度的雌激素可以直接抑制AML12 細(xì)胞的增殖活性并促進(jìn)其凋亡。TUNEL 染色也進(jìn)一步證明高濃度的雌激素可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。其可能的機(jī)制是，高濃度的雌激素可能通過影響Th1/Th2分化，增加炎癥因子TNF-α，IL-6 等的分泌，激活凋亡通路，促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡，加重對AIH 的損傷，這為臨床上部分患者在妊娠期自身免疫性肝炎的加重，提供了可能的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上，本研究結(jié)果提示，高濃度的雌二醇可能通過促進(jìn)炎癥因子TNF-α 和IL-6 的分泌，誘導(dǎo)肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡，加重AIH 小鼠肝臟炎癥反應(yīng)。但具體是如何激活內(nèi)外源凋亡通路，是否通過ERα/ERβ 等受體調(diào)控肝細(xì)胞的凋亡，是否影響調(diào)節(jié)性Tregs 細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)等機(jī)制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討。