竹粉酶解液發(fā)酵產(chǎn)γ - 聚谷氨酸研究

吳建鑫，關(guān)常道，孫苗苗，韋張其，周春陽(yáng)，劉國(guó)慶

（合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230061）

γ-PGA 是一種由DL 谷氨酸通過(guò)α - 氨基和γ -羧基通過(guò)γ 酰胺鍵結(jié)合而成的陰離子聚合物[1]，在微生物相關(guān)基因cap（Capsule） 和pgs（Polyglutamate synthase） 調(diào)控表達(dá)的γ-PGA 合成酶下，將不同構(gòu)型的谷氨酸合成不同構(gòu)型的γ-PGA[2]。經(jīng)γ-PGA 因其具有生物相容性、可生物降解性、水溶性、可食性、無(wú)毒性和環(huán)境友好性而備受關(guān)注，在食品加工、化妝品、醫(yī)學(xué)、廢水處理等方面都有應(yīng)用，其應(yīng)用廣泛且需求巨大[3]。全球森林面積約22.39 億hm2，其中竹林面積約8 879 萬(wàn)hm2，尤其中國(guó)的竹資源達(dá)到世界的1/3，每年可砍伐毛竹4 億多枝，雜竹300 多萬(wàn)t，相當(dāng)于1 000 余萬(wàn)m3木材的量，占中國(guó)每年木材采伐量的1/5 左右，原料豐富。竹子作為一種優(yōu)良的纖維原料，其主要化學(xué)組分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，一般來(lái)講，竹子由50%～70%的全纖維素、30%的戊聚糖和20%～25%的木素組成，竹子的化學(xué)成分在不同的屬種之間會(huì)有一些差別[4-5]，微生物不能直接利用竹子產(chǎn)γ-PGA，所以對(duì)竹子的前處理探討也有重要意義。由此可見(jiàn)，對(duì)以綠色原料產(chǎn)γ- PGA 的工藝研究具有重要的意義。

以葡萄糖、蔗糖、檸檬酸等為碳源，經(jīng)枯草芽孢桿菌合成γ-PGA 的傳統(tǒng)試驗(yàn)，結(jié)果表明γ-PGA 的產(chǎn)量可達(dá)20.8 g/L[6]?，F(xiàn)在也有一些以玉米小麥等秸稈合成γ-PGA 的研究[7-8]，試驗(yàn)合成的γ-PGA 產(chǎn)量達(dá)20～25 g/L[9]。而以竹子作為原料生產(chǎn)γ-PGA 的文獻(xiàn)還未被報(bào)道。由于竹子中的纖維結(jié)構(gòu)復(fù)雜、密度大，為了增大反應(yīng)的接觸面積，需要先對(duì)原料竹進(jìn)行預(yù)處理和糖化。常用預(yù)處理的方法包括物理處理法、化學(xué)處理法、酶處理和微生物處理等，其中物理處理法有機(jī)械膨化、蒸汽爆破、熱水抽提、微波等[10-12]；化學(xué)處理法有稀酸或稀堿處理，如氨水處理、NaOH 處理、稀硫酸處理等[13-14]；酶處理的酶主要有降解纖維素的纖維素酶、降解半纖維素的木聚糖酶和降解木質(zhì)素的漆酶；生物處理法在生物預(yù)處理中，白腐菌、褐腐菌和軟腐菌等微生物常被用來(lái)降解木質(zhì)素和半纖維素，其中最有效的白腐菌是擔(dān)子菌類(lèi)[15]。在前處理的過(guò)程中，氫氧化鈣預(yù)處理對(duì)秸稈的酶解糖化效率達(dá)60.38%[16]，氨法預(yù)處理秸稈的酶解糖化后，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)68.78%[7]，預(yù)處理可以明顯提高糖液中的還原糖含量。試驗(yàn)常聯(lián)合不同的預(yù)處理方法，后期的糖化效果更好[17]。張強(qiáng)等人[18]也對(duì)木糖異構(gòu)酶降解秸稈的條件進(jìn)行探究，確定了適合酶降解的條件。王振強(qiáng)等人[19]也探究了納豆芽孢桿菌利用葡萄糖發(fā)酵的相關(guān)條件。糖化過(guò)程傳統(tǒng)方法常使用纖維素、木聚糖酶、漆酶等，復(fù)合酶的糖化率更高，試驗(yàn)先對(duì)已粉碎的竹粉進(jìn)行稀堿預(yù)處理，然后分不同時(shí)段加入纖維素酶、木聚糖酶和木糖異構(gòu)酶得到糖化液，分別探討了該復(fù)合酶系得到的糖化液還原糖含量，以及不同碳源和各前體物質(zhì)對(duì)γ-PGA 生產(chǎn)的影響。對(duì)添加發(fā)酵酶系的探究，擬定了一條以竹粉原料發(fā)酵聚谷氨酸的較優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌，市售納豆菌經(jīng)分離純化得到。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 值7.0～7.2；于121 ℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏6 g/L，谷氨酸鈉30 g/L，NH4Cl 3 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，pH 值7.0～7.2；于121 ℃下滅菌20 min。

1.1.2 儀器與設(shè)備

WHY-2 型水浴恒溫振蕩器、數(shù)顯生化培養(yǎng)箱，常州國(guó)宇儀器制造有限公司產(chǎn)品；Multifuge X1 型高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；高速粉碎機(jī)，上海艦艇工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；FA1004C 型分析天平，上海越平科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑

水竹購(gòu)自安徽宣城，40 ℃下烘材料12 h 后，粉碎成100 目；谷氨酸鈉購(gòu)自市售蓮花牌袋裝味精，谷氨酸鈉含量≥99.9%；氫氧化鈉（AR），無(wú)錫佳妮化工試劑有限公司提供；苯酚（AR）、酒石酸鉀鈉（AR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；亞硫酸鈉（AR）、3,5 - 二硝基水楊酸、木聚糖酶，阿拉丁生化科技（上海） 股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 竹子的預(yù)處理和糖化液制備

（1） 預(yù)處理。堿法預(yù)處理，稱(chēng)取10 g 干燥竹粉，加入氨水溶液，放入微波爐中，處理?xiàng)l件為700 W，6 min；水浴搖床70 ℃，24 h，120 r/min。

（2） 糖化液的制備。用0.1 mol/L 的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)預(yù)處理后的竹粉，使pH 值至5.0，于50 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min糖化72 h，每隔24 h 分別加入纖維素酶、木聚糖酶和木糖異構(gòu)酶，用量均為0.03 g，酶解得到糖化液。

1.2.2 γ- PGA 的發(fā)酵

（1） 菌種活化。將斜面培養(yǎng)基的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，置于搖床上培養(yǎng)24 h。

（2） 發(fā)酵。將活化后的種子培養(yǎng)液按2%的接種量接種至裝液量為50 mL 的250 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度37 ℃，置于搖床上培養(yǎng)48 h。

1.2.3 檢測(cè)方法

（1） γ-PGA產(chǎn)量測(cè)定。將發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心20 min 除去菌體，取上清液加入15 mL 乙醇沉淀，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心20 min，將沉淀置于40 ℃恒溫干燥箱烘干后稱(chēng)量。

（2） 竹子糖液還原糖含量測(cè)定。用3,5 - 二硝基水楊酸法（DNS 法） 測(cè)定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0 進(jìn)行作圖，Excel 數(shù)據(jù)分析極差。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖異構(gòu)酶用量對(duì)酶解的單因素試驗(yàn)

取10 g 竹粉經(jīng)預(yù)處理后，調(diào)節(jié)pH 值至5.0，溫度為50 ℃，以轉(zhuǎn)速150 r/min 反應(yīng)72 h，加入纖維素酶、木聚糖酶0.03 g，木糖異構(gòu)酶用量為0，0.01，0.02，0.03，0.04 g 酶解后離心，取上清液測(cè)定還原糖含量。

木糖異構(gòu)酶用量對(duì)酶解的影響見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，木糖異構(gòu)酶的添加對(duì)竹粉的酶解有促進(jìn)作用。

2.2 竹子糖液還原糖含量的分析

通過(guò)DNS 還原糖分析，測(cè)得所制得的竹子糖液還原糖質(zhì)量濃度為16.9±3.3 g/L。對(duì)比趙宗凱等人[17]所得的還原糖質(zhì)量濃度最高可得42.37 g/L，優(yōu)化試驗(yàn)制糖工藝。

圖1 木糖異構(gòu)酶用量對(duì)酶解的影響

2.3 不同碳源對(duì)γ-PGA 產(chǎn)率的影響

作為微生物生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)，碳源能為微生物的生長(zhǎng)提供能量，因此選擇合適的碳源對(duì)于γ-PGA 發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的作用。分別使用添加量為2%的竹糖、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、可溶性淀粉為碳源，固定培養(yǎng)基其他組分進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)最終發(fā)酵所得γ-PGA 產(chǎn)量比較。

碳源種類(lèi)對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 碳源種類(lèi)對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響

由圖2 可以看出，在同樣的添加量下，利用不同的碳源發(fā)酵，其γ-PGA 產(chǎn)量有明顯區(qū)別。相比其他傳統(tǒng)的碳源，利用竹糖發(fā)酵所得的聚谷氨酸產(chǎn)量最高，為28.82 g/L，且差異顯著（p＜0.05）。這說(shuō)明竹糖中可能含有除了碳源外，其他菌體生長(zhǎng)中所需的微量元素和生長(zhǎng)因子。這些微量元素和生長(zhǎng)因子可能促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)和聚谷氨酸的產(chǎn)生。

2.4 碳源、氮源、前體物谷氨酸鈉濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)率的影響

由于不同底物質(zhì)量濃度，γ-PGA 的產(chǎn)量會(huì)有差別，因此通過(guò)只改變培養(yǎng)基里葡萄糖、酵母膏、前體物谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度，探究各個(gè)底物質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響。

葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖3，有機(jī)氮源質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4，谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響

圖4 有機(jī)氮源質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響

圖5 谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響

由圖3 可以看出，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葡萄糖質(zhì)量濃度的增加能夠促進(jìn)γ-PGA 的生成，但是當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)這個(gè)范圍則會(huì)抑制其產(chǎn)量的增加，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度超過(guò)60 g/L，γ-PGA 的產(chǎn)量增加開(kāi)始變緩慢。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L 時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到最大為19.51 g/L；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L 時(shí)，γ-PGA 產(chǎn)量下降至16.71 g/L。因此，初步可以認(rèn)為在碳源質(zhì)量濃度為80 g/L 時(shí)有最大γ-PGA 產(chǎn)量，初步選用80 g/L 為初步的最佳碳源質(zhì)量濃度。氮源不僅可以用來(lái)轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸镒陨淼慕M分，還能用來(lái)合成某些目標(biāo)產(chǎn)物，不同的微生物最適氮源也會(huì)不同，而單一的無(wú)機(jī)氮源通常不能合成較高產(chǎn)量的γ-PGA，因此探究酵母膏質(zhì)量濃度試驗(yàn)中，都添加了無(wú)機(jī)氮源NH4Cl 3 g/L。

由圖4 可以看出，γ-PGA 產(chǎn)量隨著酵母膏質(zhì)量濃度的增大先升高后下降，在酵母膏質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)達(dá)到最大值，初步選用6 g/L 作為最佳氮源質(zhì)量濃度。谷氨酸作為某些谷氨酸依賴(lài)型微生物合成γ-PGA 的合成前體[2]，也參與γ-PGA 其中的一個(gè)合成途徑。

由圖5 可以看出，該菌自身在沒(méi)有外源添加γ-PGA 的情況下也可以自身合成γ-PGA，在添加谷氨酸鈉后，γ-PGA 的產(chǎn)量隨外源谷氨酸鈉質(zhì)量濃度的增大而增大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)的成本，在60 g/L 的質(zhì)量濃度時(shí)，斜率最大，然后逐漸遞減，因此初步選用80 g/L 作為初步的最佳質(zhì)量濃度。

2.5 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)選擇合適的因素與水平進(jìn)行了L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，最優(yōu)組合下γ-PGA 產(chǎn)量見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)/g·L-1

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 最優(yōu)組合下γ-PGA 產(chǎn)量/g·L-1

由表2 的極差可以看出，聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)影響的主次關(guān)系依次為D＞A＞B＞C，即谷氨酸鈉質(zhì)量濃度＞碳源種類(lèi)＞碳源質(zhì)量濃度＞有機(jī)氮源質(zhì)量濃度。由正交試驗(yàn)得出最優(yōu)方案為A1B3C3D3，即最佳碳源種類(lèi)為竹糖，碳源質(zhì)量濃度80 g/L，有機(jī)氮源質(zhì)量濃度8 g/L，谷氨酸鈉質(zhì)量濃度80 g/L，NH4Cl 3 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 適量。并以此最優(yōu)方案得到γ-PGA 產(chǎn)量的3 次結(jié)果（見(jiàn)表3），γ-PGA 的平均產(chǎn)量為35.31 g/L。

3 結(jié)論

以竹子作為碳源，測(cè)得所制得的竹子糖液為混合糖，較單一糖源產(chǎn)γ-PGA 高。確定最佳的聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝方案，所得聚谷氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到35.31 g/L，培養(yǎng)條件可做進(jìn)一步探究，一方面竹糖液中可能含有影響微生物γ-PGA 聚合酶表達(dá)的物質(zhì)，另一方面所加的木糖異構(gòu)酶也可能會(huì)對(duì)聚谷氨酸的合成有影響。我國(guó)竹產(chǎn)業(yè)豐富，現(xiàn)有預(yù)處理和糖化工藝所得竹子糖液中還原糖含量高[18]，具有適合生產(chǎn)聚谷氨酸的可行性和科學(xué)性。