國(guó)內(nèi)部分地區(qū)豬場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)及高致病性毒株的分離與毒力鑒定

沙俊舟，焦文濤，丁旭娜，段進(jìn)坤，車(chē)艷杰，鮑恩東1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 江蘇 210095；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司研究院，天津 300308)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種高度接觸性豬的傳染病，可引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道異常等病癥。PRRS由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起，因其可引起病豬耳部和皮膚發(fā)紺，又稱(chēng)豬藍(lán)耳病。上世紀(jì)80年代末到90年代初，PRRS在北美和歐洲相繼暴發(fā)，并迅速擴(kuò)散、傳播至許多養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)[1-2]。該病病原先后在歐洲、美國(guó)被分離到，雖然兩株病毒的基因組結(jié)構(gòu)和引起的癥狀相似，但是他們的核苷酸相似度只在60%左右，所以PRRSV就被分為北美型和歐洲型兩個(gè)基因型[3-4]。1995年，PRRS傳入中國(guó)，毒株屬美洲型[5-6]。2006年，中國(guó)南方地區(qū)又暴發(fā)了PRRS，該病病原為美洲型的突變株，命名為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)，該病毒的nsp2區(qū)域和經(jīng)典株相比，存在30(1+29)個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失[7-8]。2014年開(kāi)始，有人從我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)分離到一類(lèi)與 2008 年在美國(guó)分離到的NADC30毒株有很高的核苷酸相似性的 PRRSV；自此，這類(lèi)毒株在我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)中開(kāi)始被頻繁發(fā)現(xiàn)，人們將此類(lèi)毒株命名為類(lèi) NADC30(NADC30-like)毒株[9-10]。目前，我國(guó)PRRS防控形勢(shì)嚴(yán)峻，PRRS在我國(guó)呈現(xiàn)出全國(guó)性流行的態(tài)勢(shì)，且流行毒株具有多樣性[11-14]。在眾多毒株中，高致病性毒株致病性強(qiáng)，臨床癥狀嚴(yán)重，極大地危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，仍需引起高度重視。

PRRSV為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，屬套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科中的豬動(dòng)脈炎病毒屬[15]。病毒全長(zhǎng)大約為15.0～15.4 kb，不同毒株的病毒大小差異主要集中在ORF1a上的nsp2基因區(qū)域。病毒5′端有非編碼區(qū)和帽狀結(jié)構(gòu)，3′端也存在非編碼區(qū)和poly(A)[16]。PRRSV至少包含10個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)。其中，ORF1a和ORF1b占病毒基因組全長(zhǎng)的3/4，分別編碼病毒的復(fù)制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab，并且能被自剪切成14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsps)，從5′到3′分別為nsp1α/β、nsp2-6、nsp7α/β和nsp8-12，參與病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[17]。ORF2～ORF5、ORF6、ORF7占據(jù)基因組剩下的1/4，分別編碼病毒的囊膜蛋白GP2～GP5、膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[16]。位于ORF1a中的nsp2基因變異程度最大，最多可容忍400個(gè)氨基酸的缺失，是不同毒株的主要鑒別位點(diǎn)。隨著PRRSV重組和變異的頻率加劇，GP5基因也在遺傳變異分析中作為基因分型的依據(jù)[18-19]。

本研究主要采用國(guó)標(biāo)RT-PCR方法[20-21]，對(duì)2017 至 2019年間采集自國(guó)內(nèi)14省(市)的臨床發(fā)病動(dòng)物疑似樣本，進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并以此分離到一株P(guān)RRSV毒株(命名為RP19)，對(duì)該分離病毒的nsp2和ORF5進(jìn)行序列分析，并通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)等確定了該毒株的致病性，為PRRS的防控及疫苗研制提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源

病料自安徽省、河北省、河南省、江蘇省、江西省、山西省、陜西省、湖北省、山東省、福建省、甘肅省、北京市、天津市、上海市14省、市的多個(gè)不同規(guī)模豬場(chǎng)。組織、精液以及臍帶血等共1 441份樣品均由天津渤海農(nóng)牧聯(lián)合研究院監(jiān)測(cè)中心分別于2017至2019年間收集并提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及試劑

7頭約5周齡試驗(yàn)用仔豬購(gòu)自天津市周邊豬場(chǎng)，均為經(jīng)PRRSV、PRV、PCV2核酸檢測(cè)陰性和PRRSV ELISA抗體檢測(cè)陰性的健康試驗(yàn)豬；Marc-145細(xì)胞、鼠源PRRSV N蛋白單抗由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司生物制品研究院提供；DH5α購(gòu)自上海唯地生物公司；pEASY-Blunt載體購(gòu)自北京全式金生物公司；RNAisoPlus、ExTaq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程公司；Phanta高保真DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；山羊抗小鼠Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗購(gòu)自艾博抗貿(mào)易有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司；PRRSV Ab ELISA試劑盒購(gòu)自北京金諾百泰生物公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成

采用國(guó)標(biāo)引物對(duì)收集到的病料進(jìn)行擴(kuò)增。GB2008為PRRSV的鑒定引物，GB2011為PRRSV分型引物，可鑒別經(jīng)典株和HP株。此外，根據(jù)GenBank中發(fā)布的PRRSV序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物用于部分nsp2基因和ORF5基因的序列擴(kuò)增，引物由金唯智生物公司合成(表1)。

表1 擴(kuò)增引物序列

1.4 病毒檢測(cè)

1.4.1 樣品處理

分別剪取0.3 g左右的病料組織(肺臟、胸腺、淋巴結(jié)等)，置于2 mL離心管中，加入1 mL PBS，于勻漿器中進(jìn)行研磨勻漿，13 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)于臍帶血樣品，將血液靜置析出血清后，加入2 mL于離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)于精液樣品，將其混勻后，置于1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 核酸的提取與RT-PCR鑒定

取200 μL樣品，根據(jù)RNAiso Plus參考說(shuō)明進(jìn)行RNA提取，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，用ExTaq酶分別對(duì)兩組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

12.5 μL的體系分別為：①10×PCR Buffer 1.25 μL、dNTPs 0.5 μL、GB2008上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 7 μL、ExTaq酶 0.25 μL、cDNA模板 2.5 μL；②10×PCR Buffer 1.25 μL、dNTPs 0.5 μL、GB2011 P1、P2、P3引物各0.5 μL、ddH2O 6.5 μL、ExTaq酶 0.25 μL、cDNA模板 2.5 μL。

擴(kuò)增程序分別為：①95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min；②95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。

PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳120 V，30 min進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 病毒的分離鑒定

1.5.1 PAM的制備

將6～8周齡的PRRSV、PCV2核酸和抗體檢測(cè)陰性的仔豬動(dòng)脈放血致死后，從喉頭部切開(kāi)，止血鉗盡量靠上夾住氣管(密閉)，下端勿夾住肺，無(wú)菌操作取出肺，用無(wú)菌PBS沖洗至無(wú)新鮮血液，進(jìn)入無(wú)菌間，用酒精點(diǎn)燃擦拭肺臟表面。用滅菌剪刀盡量剝離氣管周?chē)恼尺B物，用滅菌鑷子夾住肺氣管側(cè)壁，用50 mL注射器向肺臟灌含8%雙抗的PBS 150～200 mL，輕輕揉捏拍打，使肺泡充分打開(kāi)。將灌洗液傾入瓶口覆有無(wú)菌雙層紗布的三角瓶中，重復(fù)灌洗3～4次，收集灌洗液(約500 mL)，直至肺臟間隙呈透明狀。灌洗液1 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀物用20 mL含10%新生牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基重懸，1 000 r/min離心10 min。用培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，10倍、100倍稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使六孔板每孔含5×105個(gè)細(xì)胞。

1.5.2 病毒的分離

將PCR鑒定為HP毒株的陽(yáng)性病料組織上清液用0.22 μm濾器過(guò)濾后，分別接種PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞。將生長(zhǎng)良好的6孔板細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，用PBS沖洗細(xì)胞2次，按病毒液與培養(yǎng)基1∶10的比例接種。37 ℃孵育1 h，棄去上清液，使用含3%新生牛血清的培養(yǎng)基2 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，傳2～3代，約80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收取樣品，將病毒液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 病毒滴度測(cè)定

用長(zhǎng)滿單層Marc-145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。將在Marc-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的第3代病毒，用含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基作10×倍比稀釋?zhuān)?0-2～10-6稀釋度的病毒液分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔100 μL。同時(shí)設(shè)8孔作為陰性對(duì)照，每孔再補(bǔ)加100 μL 維持培養(yǎng)基。置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察4～5 d，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.6 病毒電鏡觀察

將接毒后的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min 離心15 min，去掉細(xì)胞碎片。取上清液，加入終濃度7%的PEG6000，混勻后于4 ℃過(guò)夜沉淀。將PEG與病毒的混合液10 000 r/min離心30 min。棄去上清，用 1.5 mL 無(wú)菌PBS重懸附著于離心管底部的病毒粒子，負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

將Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)24 h的第3代病毒，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次。使用-20 ℃預(yù)冷的甲醇在-20 ℃環(huán)境下固定細(xì)胞10 min。除去甲醇，用PBST清洗2次，每次5 min。以2%的BSA溶于PBST作為稀釋液，按1∶2 000的比例對(duì)鼠源單抗進(jìn)行稀釋?zhuān)尤雴慰梗?7 ℃孵育1 h。PBST清洗3次細(xì)胞，每次5 min。用1∶1 000比例以上述稀釋液稀釋Alexa Fluor?488標(biāo)記二抗，加入二抗，37 ℃孵育1 h。PBST清洗3次細(xì)胞，每次10 min。在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 擴(kuò)增nsp2基因和ORF5基因

以Phanta高保真酶分別擴(kuò)增RP19的nsp2基因和ORF5基因。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL、上、下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將目的條帶裁切回收，膠回收后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)方法連接pEASY-Blunt載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)。涂布過(guò)夜后挑取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落，提取質(zhì)粒送往金唯智生物公司測(cè)序。

1.9 序列分析

從GenBank上下載國(guó)內(nèi)外PRRSV代表毒株，毒株信息見(jiàn)表2。將nsp2和ORF5基因的序列通過(guò)Lasergen與Mega 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并把氨基酸序列與代表毒株進(jìn)行比對(duì)分析。

表2 PRRSV參考毒株信息

1.10 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取7頭試驗(yàn)仔豬，隨機(jī)分為2組，其中攻毒組5頭和對(duì)照組2頭。攻毒組的每頭仔豬滴鼻2 mL，病毒含量105.0TCID50/mL。對(duì)照組滴鼻DMEM 2 mL。每日進(jìn)行直腸測(cè)溫，并觀察臨床癥狀。在攻毒后0、3、7、11、21 d分別采血，分離血清，使用PRRSV Ab ELISA試劑盒檢測(cè)N蛋白抗體。每7日進(jìn)行一次體重測(cè)量，連續(xù)觀察21 d。所有存活仔豬采用安樂(lè)死在21 d進(jìn)行剖檢。觀察其肺臟大體的病變，并用10%福爾馬林溶液固定保存肺組織，以備組織病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 病料樣品RT-PCR檢測(cè)

通過(guò)對(duì)14個(gè)省(市)共計(jì)1 441例疑似病料的GB2008引物檢測(cè)，部分樣品擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增為陽(yáng)性的病料有319份，陽(yáng)性檢出率為22.14%，其中病料陽(yáng)性檢出率較高的地區(qū)有江西省41.94%(39/93)、安徽省39.73%(29/73)、上海市35.94%(23/64)。病料陽(yáng)性檢出比例較低的地區(qū)有福建省17.35%(17/98)、江蘇省10%(3/30)、天津市6.9%(2/29)。經(jīng)GB2011引物擴(kuò)增為HP-PRRSV感染的樣品有169例，占陽(yáng)性病料的52.98%(169/319)，說(shuō)明感染了HP-PRRSV，該毒珠仍為近幾年P(guān)RRSV的流行毒株。

2.2 病毒的分離

將處理的陽(yáng)性病料上清液接種PAM細(xì)胞，只有1份病料接種72 h后產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞破碎、皺縮、脫落；其他陽(yáng)性病料未出現(xiàn)細(xì)胞病變，盲傳3代后仍未出現(xiàn)病變棄掉。該毒株命名為RP19。將RP19株接種Marc-145細(xì)胞后，細(xì)胞病變時(shí)間顯著增長(zhǎng)。96 h只是出現(xiàn)細(xì)胞部分變圓和聚集，直到120 h才出現(xiàn)細(xì)胞破碎、脫落現(xiàn)象。

2.3 病毒滴度測(cè)定

經(jīng)TCID50測(cè)定，RP19于Marc-145細(xì)胞上第3代的病毒含量為105.9TCID50/mL。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.部分檢測(cè)樣品；9.陽(yáng)性對(duì)照；10.陰性對(duì)照;A.GB2008引物擴(kuò)增結(jié)果;B.GB2011引物擴(kuò)增結(jié)果圖1 部分樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 病毒電鏡觀察

病毒樣品經(jīng)過(guò)負(fù)染后，透射電鏡下可觀察到呈現(xiàn)球狀的病毒粒子，直徑約50～72 nm，表面有微小的纖突，見(jiàn)圖2。

圖2 病毒粒子透射電鏡觀察

2.5 間接免疫熒光試驗(yàn)

對(duì)在Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)24 h的RP19進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)觀察。正常細(xì)胞，無(wú)綠色熒光(圖3A)，而大量病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光(圖3B)。

A.陰性細(xì)胞對(duì)照;B.RP19感染24 h后的細(xì)胞圖3 PRRSV間接免疫熒光測(cè)試結(jié)果(100×)

2.6 nsp2基因和ORF5基因的擴(kuò)增

分別對(duì)nsp2和ORF5基因?qū)P19株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，nsp2目的條帶大小為950 bp，ORF5目的條帶大小為640 bp(圖略)，均與預(yù)期結(jié)果相符。

2.7 序列分析

使用MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法對(duì)RP19與國(guó)內(nèi)外代表性毒株分別進(jìn)行nsp2基因和ORF5基因的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。美洲型分為以VR-2332為代表的經(jīng)典株、以JXA1為代表的HP株和以NADC30為代表的NADC30-like毒株。RP19株在進(jìn)化樹(shù)上屬于HP毒株，與TJ株最為接近。

使用MegAlign軟件對(duì)nsp2基因和ORF5基因和國(guó)內(nèi)外代表毒株進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果如圖4顯示。RP19毒株的nsp2基因具有典型HP毒株特征，即與經(jīng)典毒株相比具有30(1+29)個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。ORF5基因的氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示，雖然核苷酸有些許不同，但為氨基酸不變的同義突變，RP19的信號(hào)肽、中和表位和3段跨膜區(qū)都與JXA1、TJ、HuN4等HP株一致(圖4)。nsp2與ORF5基因的序列分析結(jié)果表明，此次分離RP19株為典型的HP-PRRSV。

圖4 ORF5基因氨基酸對(duì)比結(jié)果

2.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

5周齡受試仔豬在感染RP19毒株后第3天后開(kāi)始出現(xiàn)體溫升高，持續(xù)約7～10 d，體溫在攻毒后的第5～8天時(shí)達(dá)到高峰，13 d后體溫逐漸下降并恢復(fù)至正常(圖5)。攻毒后受試仔豬出現(xiàn)采食減少、精神沉郁等癥狀。于攻毒后第4天出現(xiàn)呼吸急促、喜臥等癥狀，并伴有咳嗽、噴嚏。攻毒后第7天受試仔豬出現(xiàn)皮膚潮紅、顫抖、后肢麻痹等癥狀。5頭仔豬在感染后期出現(xiàn)1頭死亡。陰性對(duì)照組的各受試仔豬在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中體溫、采食和精神狀態(tài)均表現(xiàn)正常，未觀察到任何異常現(xiàn)象。

圖5 試驗(yàn)仔豬直腸溫度變化

各組受試仔豬在攻毒前均稱(chēng)量體重并記錄。此后每周測(cè)一次，于試驗(yàn)結(jié)束宰殺后分析其體重增長(zhǎng)情況，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。攻毒組豬在0～7 d、7～14 d、14～21 d這3個(gè)時(shí)間段的日增重均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

**表示差異極顯著(P<0.01)圖6 試驗(yàn)仔豬平均日增重

各組受試仔豬血清中抗行檢測(cè)結(jié)果顯示，仔豬在攻毒前抗體水平均處于檢測(cè)限以下，對(duì)照組受試仔豬在整個(gè)試驗(yàn)期間的血清抗體水平均為陰性，而攻毒組受試仔豬的血清抗體于第7天開(kāi)始被檢測(cè)到，隨后抗體水平隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，直到試驗(yàn)結(jié)束(圖7)。

圖7 試驗(yàn)仔豬血清中PRRSV抗體水平變化

在攻毒后21 d對(duì)所有存活試驗(yàn)豬均進(jìn)行安樂(lè)死并剖檢。剖檢結(jié)果顯示，攻毒組仔豬的肺臟出現(xiàn)淤血水腫，肺臟邊緣出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性病變(圖8)。病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，攻毒組仔豬的肺臟出現(xiàn)以彌散性間質(zhì)性肺炎為特征的變化，肺間質(zhì)中結(jié)締組織出現(xiàn)增生，肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，肺泡間隔淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分肺泡消失，剩余的肺泡出現(xiàn)代償性擴(kuò)張(圖9)。

A.對(duì)照組仔豬肺臟;B.攻毒組仔豬肺臟圖8 仔豬肺臟大體觀察

A.對(duì)照組肺組織；B.攻毒組肺組織間隔明顯增寬，肺泡消失且有代償性肺泡擴(kuò)張圖9 仔豬肺臟的病理組織學(xué)變化(100×)

3 討論

PRRS是一種對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)具有重大影響的傳染病。從上世紀(jì)80年代在美國(guó)被首次分離后就一直影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。我國(guó)PRRS的流行經(jīng)歷了三個(gè)階段：1996年以Ch-1a為代表的經(jīng)典株流行；2006年以JXA1為代表的HP株流行；2014年至今以NADC30為代表的類(lèi)NADC30株流行。PRRSV為RNA病毒，極易變異，其ORF1a編碼的nsp2基因能忍受大片段的基因突變和缺失，并且這種突變可不斷地累加。另外，不同毒株之間會(huì)頻繁發(fā)生基因重組[11,21]。尤其是國(guó)外引種、免疫弱毒活疫苗等方式不規(guī)范等，導(dǎo)致了國(guó)內(nèi)國(guó)外毒株的重組、野毒疫苗毒毒株的重組等問(wèn)題，而且弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，加劇了PRRS的流行。

PRRS是影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)時(shí)間最持久、損失最嚴(yán)重的動(dòng)物疫病之一，尤其是2006年暴發(fā)的HP-PRRS，由于其高致病率和高死亡率的特征，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究以國(guó)標(biāo)RT-PCR檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)2017至2019年期間采自我國(guó)14省(市)的1 441份PRRS感染疑似病料進(jìn)行檢測(cè)而開(kāi)展起來(lái)的。結(jié)果顯示，共有319份病料樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為22.14%，其中HP-PRRSV感染的樣品約占陽(yáng)性病料的52.98%，說(shuō)明HP-PRRS至今已經(jīng)在國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬場(chǎng)廣泛流行，仍需對(duì)其進(jìn)行重點(diǎn)防范。另外，PRRS在不同地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)的流行狀況是存在一定差異的，江西、安徽、上海等地養(yǎng)豬場(chǎng)中PRRS的感染情況比較嚴(yán)重，HP-PRRSV株占大多數(shù)，需要進(jìn)行針對(duì)性的防控。

通過(guò)對(duì)篩選到的PRRS陽(yáng)性病料進(jìn)行處理，并接種到PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞，利用電鏡觀察、IFA以及HP-PRRSV特異性引物進(jìn)行鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法，成功分離到1株HP-PRRSV(RP19)。因2019年采集到的病料較少，且病料沒(méi)有立即進(jìn)行病毒分離，目前只分離到1株病毒。為進(jìn)一步探究該毒株RP19的遺傳演化規(guī)律，對(duì)其關(guān)鍵性的nsp2基因和ORF5基因進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示RP19與HP代表毒株TJ株最為接近。ORF5基因編碼GP5蛋白，GP5蛋白存在免疫原性較高的抗原表位，而抗原表位一定程度上決定了病毒的免疫特性。在ORF5的比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，GP5蛋白重要的氨基酸位點(diǎn)未發(fā)生突變，呈現(xiàn)典型的HP毒株的特點(diǎn)。為了驗(yàn)證RP19的致病性，本文還對(duì)5周齡仔豬進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，RP19株能引起仔豬嚴(yán)重的臨床癥狀，有一定的致死毒力，可引起感染仔豬發(fā)生彌散性間質(zhì)性肺炎等病理變化及相應(yīng)的臨床癥狀。

由于HP-PRRS依然為國(guó)內(nèi)流行毒株，HP-PRRSV占PRRSV陽(yáng)性樣品的52.98%，且存在高度傳染性、致病性，因此以HP-PRRSV為抗原制備疫苗預(yù)防PRRS非常必要。本研究結(jié)果為國(guó)內(nèi)PRRSV的疫苗生產(chǎn)和使用提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。