法氏囊活性肽BP7調(diào)節(jié)雞未成熟B細胞的基因表達譜及功能分析

李彤彤，張則，陳佳靜，李陳飛，盧安然，周廣防，馮秀麗

( 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物細菌學(xué)重點實驗室/教育部動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 南京 210095)

眾所周知，法氏囊(bursa of fabricius，BF)是公認的鳥類特有的中樞體液免疫器官，為研究人類及哺乳動物的中樞體液器官功能機制、疫苗開發(fā)等提供了理想的研究模型[1-3]。早在1956年，手術(shù)切除新生雛雞的法氏囊損害了該雞只對鼠傷寒沙門菌O型抗原2的抗體反應(yīng)，就證實了法氏囊是鳥類B淋巴細胞生成的關(guān)鍵部位[1-3]。科研人員對法氏囊功能機制研究發(fā)現(xiàn)，與人或小鼠模型相比，鳥類B細胞的發(fā)育具有一些獨特的特性。據(jù)報道B細胞的發(fā)育經(jīng)歷了3個不同的階段，即法氏囊前、法氏囊和法氏囊后，這3個階段在B細胞發(fā)育中所起的作用有根本的不同[4-5]。B細胞分化和抗體多樣化伴隨著生物活性分子的調(diào)節(jié)和免疫誘導(dǎo)的激活[3,6]。法氏囊源的活性分子對B細胞及抗體的影響是科研人員非常關(guān)注的話題。囊素三肽(Lys-His-Gly-NH2)是最早報道的來源于BF的活性分子，可促進B細胞的分化[7]，可選擇性誘導(dǎo)雞B細胞分化，促進免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)從IgM向IgG的轉(zhuǎn)變[8]。法氏囊來源的法氏囊五肽Ⅱ(bursal pentapeptide，BPP-Ⅱ)，調(diào)節(jié)了禽前B淋巴細胞DT40參與同源重組的各種基因表達，增強了雞免疫抗體的產(chǎn)生[9]。而且，BPP-Ⅱ能夠調(diào)節(jié)涉及多種途徑和免疫相關(guān)的生物學(xué)過程的雜交瘤細胞中多個基因的差異表達[10]。這些結(jié)果揭示了法氏囊源活性多肽調(diào)節(jié)抗體反應(yīng)及B細胞功能的機制，不過法氏囊源活性肽調(diào)節(jié)未成熟B細胞的功能及分子基礎(chǔ)還有待于進一步探索。

法氏囊活性肽BP7是近期報道的一種來源于法氏囊、促進抗體反應(yīng)及B細胞自噬的一種活性七肽[11]。為了研究法氏囊源性肽對雞未成熟B細胞的調(diào)節(jié)作用，本研究采用基因芯片，對BP7處理后DT40細胞的基因表達譜進行了篩選，并應(yīng)用富集途徑和功能分類分析方法，對禽未成熟B細胞系DT40細胞中差異表達的基因及生物學(xué)功能進行分析，從而為未成熟B細胞的分化發(fā)育提供重要的參考信息。

1 材料與方法

1.1 法氏囊活性肽和細胞系

BP7由南京金斯瑞科技公司合成，純度為95%以上。

DT40細胞由本實驗室保存，采用含有10%胎牛血清和5%雞血清的1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 DT40細胞的培養(yǎng)及檢測

將生長狀態(tài)良好的DT40細胞分裝到6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h后，將2 μg/mL、0.2 μg/mL、0.02 μg/mL 3個劑量的BP7加入到6孔細胞板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時設(shè)計PBS和0.02 μg/mL BSA分別作為對照。收獲全細胞，加入TRIzol試劑提取總RNAs，設(shè)計DT40細胞的IgM引物序列，Primer-F-GTCAAAGGAGGAGCTGAACG和Primer-R-TGTGTGTGACCCTGCAGGTG，采用一步法定量PCR試劑盒檢測IgM的mRNA水平。

1.3 基因芯片分析

將生長狀態(tài)良好的DT40細胞分裝到T25細胞培養(yǎng)瓶中，然后用0.02 μg/mL BP7加入到細胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收獲全細胞，加入TRIzol試劑提取總RNAs，由北京博奧公司完成基因表達譜分析。試驗步驟為：采用TRIzol (Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA)提取細胞中的總 RNA。并進一步采用 NucleoSpin?RNA清理試劑盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)對總 RNA 進行過柱純化及質(zhì)檢合格。

樣品RNA的熒光標(biāo)記及雜交，即采用晶芯?cRNA 擴增標(biāo)記試劑盒進行樣品RNA 熒光標(biāo)記。基本步驟如下：以總RNA起始，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈，然后用RNase H 將雜合鏈中的RNA 切成短片段，DNA 聚合酶 以RNA短片段為引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并純化雙鏈cDNA。以cDNA 為模板，體外轉(zhuǎn)錄合成 cRNA；然后用CbcScriptⅡ酶，隨機引物反轉(zhuǎn)錄；最后cDNA用KLENOW酶標(biāo)記。標(biāo)記的DNA溶于雜交液中(2倍GEx Hyb Buffer，HI-RPM,25%甲酰胺)，于45 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42 ℃左右含0.2%十二熔基硫酸鈉(SDS)，2倍檸檬酸鈉緩沖液(SSC)的液體中洗5 min，而后在0.2倍SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

芯片用安捷倫芯片掃描儀進行掃描，得到雜交圖片。采用特征提取圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，并采用GeneSpring GX軟件對信號值進行歸一化處理，然后用絕對變化倍數(shù)≥2進行差異基因篩選，并進一步開展差異表達基因的通路分析，即在GenMAPP和KEGG的系列通路中的分布情況。此外，基因本體論(Gene Ontology,GO)分析差異表達基因在GO體系中各亞型分類的情況。

1.4 靶基因的定量PCR(RT-qPCR)檢測

用0.02 μg/mL BP7處理DT40細胞4 h，提取細胞總RNA，從芯片數(shù)據(jù)的差異表達的基因中，隨機選擇Ppara、Atg2a1、Rap1b、Fzr1、Fgf8、Gal13等6個差異表達基因，設(shè)計引物進行驗證。特異引物序列如表1所示。

表1 選定基因的定量PCR引物

使用ABI 7300實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行RT-qPCR操作。GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 BP7誘導(dǎo)雞未成熟B細胞分泌IgM產(chǎn)生

以DT40細胞系為模型，BP7刺激后檢測IgM水平，結(jié)果如圖1所示。與PBS對照組相比，經(jīng)0.02 μg/mL BP7刺激的DT40細胞組，產(chǎn)生的IgM mRNA水平明顯升高(圖1A)，而0.2 μg/mL和2 μg/mL BP7刺激的DT40細胞組的IgM水平與PBS對照組相似，無顯著差異。同時，0.02 μg/mL BP7刺激的DT40細胞組產(chǎn)生的IgM mRNA水平也明顯高于0.02 μg/mL BSA對照組(圖1B)。

2.2 BP7調(diào)節(jié)DT40細胞的基因表達譜

以DT40細胞為模型，采用基因芯片技術(shù)檢測了0.02 μg/mL BP7刺激的DT40細胞的基因表達譜，結(jié)果如圖2所示。熱圖分析顯示了BP7處理后DT40細胞中的基因表達情況(圖2A)。在規(guī)定的閾值下，與對照組相比，BP7處理的DT40細胞中有733個上調(diào)基因和612個下調(diào)基因(圖2B)，其中BP7處理的DT40細胞中大部分基因的調(diào)控倍數(shù)在1和-1 lg2比值之間(圖2B)。

為了證實基因芯片的基因表達數(shù)據(jù)，采用qRT-PCR技術(shù)，從芯片數(shù)據(jù)中差異表達的基因中，隨機檢測了BP7處理DT40細胞的6個差異表達基因。與對照組相比，BP7處理后DT40細胞Ppara、Atg2a1和Rap1b基因表達上調(diào)，而Fzr1、Fgf8和Gal13基因表達下調(diào)。這些結(jié)果與BP7處理的DT40細胞的基因芯片數(shù)據(jù)分析一致(圖2C)

2.3 BP7調(diào)節(jié)DT40細胞的通路分析

為了全面了解雞未成熟B細胞的生物途徑調(diào)控，利用GAGE分析工具，在KEGG數(shù)據(jù)庫和PANTHER數(shù)據(jù)庫中，對BP7處理的DT40細胞的差異基因所涉及的信號和代謝途徑進行分析,結(jié)果如表2所示。BP7誘導(dǎo)DT40細胞的差異表達基因涉及17條通路，包括神經(jīng)活性配體受體相互作用、ECM受體互作、細胞因子與細胞因子受體互作3個受體互作通路，以及胰島素/IGF途徑蛋白激酶B信號級聯(lián)、泛素蛋白酶體途徑、胰島素/IGF途徑絲裂原活化蛋白激酶/MAP激酶級聯(lián)和Jak-STAT 信號通路4個信號通路。代謝和蛋白質(zhì)分解相關(guān)的通路包括煙酸和煙酰胺代謝、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解和黑色素生成3種。此外，其他細胞生物學(xué)功能相關(guān)的通路包括緊密連接、粘著、粘合連接、ABC轉(zhuǎn)運子、血管平滑肌收縮、縫隙連接和吞噬體。此外，本文還對BP7刺激DT40細胞的差異基因涉及的通路進一步分析，其富集途徑網(wǎng)絡(luò)如圖3所示。c細胞因子與細胞因子受體互作是BP7刺激后DT40細胞相關(guān)途徑中的關(guān)鍵通路，與Jak-STAT信號通路、粘合連接和縫隙連接等通路密切相關(guān)。

A.基因表達譜熱圖；B.差異表達基因柱狀圖分析；C.差異基因驗證圖2 BP7調(diào)節(jié)DT40細胞的基因表達譜

表2 BP7刺激后DT40細胞中差異表達基因涉及的通路分析

續(xù)表2

圖3 BP7刺激后DT40細胞中涉及的通路相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 BP7調(diào)節(jié)DT40細胞中GO功能分析

為進一步探討B(tài)P7在未成熟B細胞生物學(xué)功能中的分子基礎(chǔ)，根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫對BP7刺激的DT40細胞的差異表達基因進行了細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程分析。圖4總結(jié)了P值TOP30的顯著富集項。BP7處理的DT40細胞中P值TOP30的GO項中，包括15個分子功能，8個生物過程和7個細胞成分。

圖4 BP7刺激后DT40細胞差異表達基因涉及的GO功能分析(P值在TOP30以內(nèi))

為了證實免疫系統(tǒng)的分子特征，本文還分析了參與免疫相關(guān)功能過程的差異基因表達。如表3所示，在BP7處理的DT40細胞中，涉及的免疫相關(guān)GO項主要包括免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答信號、Th1型免疫應(yīng)答、細胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)及其受體活性等方面。

表3 BP7刺激后DT40細胞中差異表達基因涉及的免疫相關(guān)功能分析

3 討論

法氏囊是目前公認的鳥類特有的中樞免疫器官，是B淋巴細胞分化成熟的關(guān)鍵部位。然而法氏囊源生物活性肽在未成熟B細胞發(fā)育中獨特的分子基礎(chǔ)和作用機制卻鮮有報道。DT40細胞是來源于禽白血病病毒感染引起的法氏囊淋巴瘤細胞，是一種常見的、研究B細胞功能和機制的未成熟B細胞模型[12-13]。BP7是近期報道的一種法氏囊活性肽，能夠促進明顯的疫苗免疫反應(yīng)，且誘導(dǎo)鼠源未成熟B細胞中多種信號通路，同時發(fā)現(xiàn)BP7促進鼠源未成熟B細胞自噬[11]，然而其調(diào)控雞B細胞的功能機制尚不清楚。

為了探討B(tài)P7對雞未成熟B細胞的作用機制，本研究中選擇禽DT40細胞作為雞未成熟B細胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.02 μg/mL BP7能顯著提高DT40細胞IgM的mRNA水平。高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，BP7誘導(dǎo)DT40細胞中差異表達的基因涉及到胰島素/IGF途徑蛋白激酶B信號級聯(lián)、泛素蛋白酶體途徑、胰島素/IGF途徑絲裂原活化蛋白激酶/MAP激酶級聯(lián)和Jak-STAT信號通路4個信號通路。胰島素樣生長因子受體的上游調(diào)節(jié)因子Klotho在CD19+B細胞中高表達，提示了胰島素通路參與了B細胞相關(guān)的淋巴瘤的發(fā)展[14 ]。泛素化蛋白通路參與B細胞的介導(dǎo)的MHC-Ⅱ抗原遞呈功能且與BCR功能相關(guān)[15]。據(jù)報道，MAP激酶級聯(lián)和Jak-STAT信號通路也參與B細胞的生物過程[16-17]。這些結(jié)果提示，多種信號通路可能均參與B細胞的分化發(fā)育過程。為了進一步探索BP7調(diào)節(jié)的通路對B細胞的功能，本文中通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，細胞因子與細胞因子受體互作是BP7刺激DT40細胞的重要靶功能通路。據(jù)報道，抗原和細胞因子受體信號引導(dǎo)未成熟B細胞的發(fā)育[18]。本研究中，GO通路分析發(fā)現(xiàn)，BP7能夠調(diào)節(jié)未成熟B細胞中細胞因子的產(chǎn)生及分泌。由此可以推測，上述信號通路與B細胞發(fā)育及分化成熟等生物學(xué)功能密切相關(guān)。

此外，差異表達的基因還參與了多種免疫相關(guān)的生物學(xué)過程，主要包括免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答信號、Th1型免疫應(yīng)答、細胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)及其受體活性等方面。未成熟B細胞的分化成熟是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，而且B細胞發(fā)育不僅是體液免疫反應(yīng)的重要組成部分，也是先天性免疫及獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分[19-20]?？乖图毎蜃邮荏w信號引導(dǎo)幼稚成熟B細胞的發(fā)育。未成熟B細胞到外周成熟B細胞池的陽性選擇主要受強BCR信號調(diào)節(jié)，其次受BAFFR信號調(diào)節(jié)。這些信號促進了未成熟B細胞向過渡和成熟B細胞的分化，對成熟B細胞的存活起重要作用[21]。Th1免疫反應(yīng)與B細胞分化及功能密切相關(guān)[22-23]。本研究結(jié)果顯示，法氏囊活性肽BP7能夠促進B細胞分泌IgM，揭示了其調(diào)節(jié)B細胞的分子基礎(chǔ)，為研究B細胞的分化成熟及功能機制提供了重要的理論依據(jù)。

總之，本研究證實了法氏囊活性肽BP7能夠誘導(dǎo)禽未成熟B細胞產(chǎn)生顯著的IgM水平；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BP7誘導(dǎo)雞未成熟B細胞的差異表達基因參與了多種通路，其中細胞因子受體互作是其中的關(guān)鍵通路，而且涉及到多種免疫相關(guān)的生物學(xué)過程。研究結(jié)果為進一步研究法氏囊活性肽調(diào)控B細胞分化的分子機制奠定了基礎(chǔ)。