禽腺病毒血清4型貴州流行株分離及其致病性分析

李喬斌，張?jiān)频?，何玲，岳筠，尹德晶，文?2，程振濤,2*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550008)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒分為5個(gè)種(A、B、C、D和E種)，12個(gè)血清型[1]。Ⅰ群禽腺病毒感染病例主要表現(xiàn)為包涵體肝炎(IBH)和雞心包積液綜合征(hydropericardium syndrome，HPS)[2]。安卡拉病(AD)即雞心包積液綜合征是由Ⅰ群禽腺病毒C種血清4型(FAdV-4)引起，其主要臨床癥狀為心包積液和包涵體肝炎[3]，因其于1987年在巴基斯坦安卡拉地區(qū)首先報(bào)道而得名。目前HPS在世界很多國(guó)家地區(qū)暴發(fā)，包括北愛(ài)爾蘭、美國(guó)、加拿大、日本、匈牙利、秘魯、印度、西班牙、中國(guó)等[4-6]。我國(guó)自2012年，HPS的臨床病例在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)始增加，2015年在全國(guó)大范圍暴發(fā)，病原被確定為FAdV-4[7]。2016年7月貴州某肉雞場(chǎng)發(fā)生一起急性傳染病，主要引起3～6周齡雞群發(fā)病[8]，病死雞心包積液呈現(xiàn)稻草色膠狀，多數(shù)病例呈現(xiàn)肝炎和腎炎，死亡率達(dá)到30%至90%[9]，懷疑為FAdV-4感染所致。研究資料表明，各地雞心包積液綜合征病原毒株存在不同程度的變異，而毒株的差異也帶來(lái)致病性的差異。本文開(kāi)展了FAdV-4貴州株的分離鑒定以及動(dòng)物感染試驗(yàn)，并對(duì)其培養(yǎng)特性和致病性進(jìn)行探究，為明確FAdV-4在貴州省的流行情況和開(kāi)展防控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料、試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

FAdV-4核酸陽(yáng)性雞肝臟組織樣本，采自貴州畢節(jié)地區(qū)某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)；SPF雞胚購(gòu)自山東益吉達(dá)生物科技有限公司；雞肝癌細(xì)胞系(LMH)由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。FAdV-4 疫苗株，由貴州福斯特生物有限公司提供。

1.2 主要試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)自Gibco公司；鼠抗雞IgG-FITC，購(gòu)自武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司；FAdV-4陽(yáng)性血清，購(gòu)自貴州福斯特生物有限公司；病毒DNA提取試劑盒、DL 2000 DNA Maker、2×TaqPCR Mix均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照FAdV-4全基因序列(GU188428)，以Hexon為靶基因，選擇其保守序列片段，應(yīng)用Primer Pemier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成1對(duì)普通引物FAdV-4F/R，1對(duì)real time熒光引物(FAdV-4F1/R1)和1條探針(FAdV-4-T)，在探針的5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)，在探針的3′端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)(BHQ)，以上探針和引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒分離培養(yǎng)及PCR檢測(cè)

將FAdV-4核酸陽(yáng)性雞肝臟樣本加入PBS磨碎，凍融3次，12 000 r/min、4 ℃離心7 min。取上清液過(guò)濾除菌，濾液作為接種樣本，接種于LMH細(xì)胞在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察的細(xì)胞病變(CPE)，同時(shí)設(shè)好陰性對(duì)照。待85%細(xì)胞培養(yǎng)到出現(xiàn)CPE，收集病變細(xì)胞的培養(yǎng)物，8 000 r/min 4 ℃離心15 min后，取上清接種LMH細(xì)胞傳代，傳5代后，取24 h、48 h、72 h細(xì)胞培養(yǎng)物，分別提總DNA，用引物FAdV-4-F/R PCR檢測(cè)FAdV-4。

1.5 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)

按照0.2 mL/孔接種5代細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)設(shè)置未接種培養(yǎng)物的細(xì)胞作為空白對(duì)照，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)戊二醛固定后，加入5% BSA封閉1 h，以FAdV-4陽(yáng)性血清(1∶50)為一抗，鼠抗雞IgG-FITC(1∶500)為二抗，經(jīng)IFA檢測(cè)確定是否感染FAdV-4。

1.6 分離病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的電鏡觀察

參照文獻(xiàn)[10]方法，收集5代細(xì)胞培養(yǎng)物，1 200 r/min、4 ℃離心10 min后棄上清，加入細(xì)胞固定液制作切片，然后經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，進(jìn)行電鏡觀察。

1.7 動(dòng)物感染試驗(yàn)

1.7.1 純化分離病毒及TCID50測(cè)定

準(zhǔn)備LMH細(xì)胞，按照每孔100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿75%細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí)，用DMEM培養(yǎng)基把病毒液進(jìn)行10倍梯度進(jìn)行稀釋(從10-1至10-11)，將稀釋后的病毒接種LMH細(xì)胞，每孔50 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，觀察CPE至72 h，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50；將所測(cè)病毒液用聚乙二醇(PEG)沉淀法進(jìn)行病毒純化，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 雞胚感染試驗(yàn)

對(duì)7日齡的SPF雞胚進(jìn)行注射1.7.1所純化的病毒液(0.2 mL/胚)，37 ℃培養(yǎng)120 h后無(wú)菌收集雞絨毛尿囊膜，盲傳3代，解剖雞胚并觀察病理變化；提取雞絨毛尿囊膜的DNA樣本，應(yīng)用引物(FAdV-4-F/R)進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置正常雞胚對(duì)照。

1.7.3 雛雞感染試驗(yàn)

將1日齡的SPF雞胚分成感染組和對(duì)照組，每組10只，接種方式為肌肉注射，感染組接種已純化的病毒液，0.2 mL/只，對(duì)照組接種ddH2O，0.2 mL/只。每天觀察各組雞群臨床表現(xiàn)，隨機(jī)采集5只病死或人工處死雞的心臟、心包積液、肝臟、肺臟、脾臟和腎臟等樣本，研磨處理后，提取各組織樣本DNA，按照文獻(xiàn)[11]所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。以引物FAdV-4F1/R1和探針FAdV-4-T經(jīng)qPCR檢測(cè)各組織樣品中的 FAdV-4。20 μL qPCR反應(yīng)體系(Premix ExTaq10 μL，DNA 模板2 μL，F(xiàn)AdV-4 F1/R1 各1 μL，F(xiàn)AdV-4-T 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。)反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)與PCR檢測(cè)

將FAdV-4核酸陽(yáng)性肝臟樣本勻漿濾液接種于LMH細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，結(jié)果可見(jiàn)肝臟樣本接種LMH細(xì)胞后于72 h出現(xiàn)CPE，而正常細(xì)胞無(wú)CPE，見(jiàn)圖1。

圖1 LMH細(xì)胞病變情況

將FAdV-4感染LMH細(xì)胞培養(yǎng)物盲傳5代后，取24 h、48 h、72 h細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4分離株第5代24 h、48 h、72 h培養(yǎng)物均能擴(kuò)增出295 bp目的基因條帶，而正常細(xì)胞對(duì)照無(wú)條帶擴(kuò)增(圖2)。上述結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)物中存在FAdV-4。

M.DL 2000 DNA Marker；+.FAdV-4疫苗毒株；-.去離子水對(duì)照；1～3.感染FAdV-4 24 h、48 h、72 h細(xì)胞培養(yǎng)物；4～6.24 h、48 h、72 h正常細(xì)胞圖2 細(xì)胞培養(yǎng)物中FAdV-4 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 分離病毒的IFA檢測(cè)

對(duì)FAdV-4感染后細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(正常細(xì)胞)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。FAdV-4感染的細(xì)胞觀察到綠色熒光(圖3A)，而空白對(duì)照組無(wú)綠色熒光(圖3B)。結(jié)果表明，感染細(xì)胞48 h的培養(yǎng)物中存在FAdV-4，從抗原水平上進(jìn)一步證實(shí)感染細(xì)胞中FAdV-4的存在。

A.正常細(xì)胞；B.FAdV-4感染細(xì)胞圖3 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(400×)

2.3 分離病毒的電鏡觀察

將感染FAdV-4的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物制作切片，加入細(xì)胞固定液，然后經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4。在電鏡下可以明顯的觀察到病毒粒子呈球形、無(wú)囊膜、直徑70～90 nm，呈晶狀體布列，具有禽腺病毒典型的二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。而正常細(xì)胞對(duì)照無(wú)特定病毒粒子結(jié)構(gòu)存在。表明用FAdV-4核酸陽(yáng)性肝臟樣本接種LMH細(xì)胞后，細(xì)胞中存在FAdV-4病毒粒子。

通過(guò)對(duì)肝臟樣本接種細(xì)胞進(jìn)行FAdV-4 PCR、IFA和電鏡檢測(cè)，證實(shí)從采集自貴州畢節(jié)某養(yǎng)殖場(chǎng)的FAdV-4核酸陽(yáng)性肝臟樣本中分離獲得FAdV-4，命名為FAdV-4-GZJS。

A.正常LMH細(xì)胞；B.FAdV-4感染LMH細(xì)胞圖4 FAdV-4病毒粒子電鏡觀察(20 000×)

2.4 動(dòng)物感染試驗(yàn)

2.4.1 純化FAdV-4的TCID50測(cè)定

將接種LMH細(xì)胞的FAdV-4病毒液進(jìn)行純化過(guò)后，10倍梯度稀釋(從10-1至10-11)，每個(gè)梯度重復(fù)8孔，觀察CPE至72 h，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的滴度為1×107TCID50/mL。

2.4.2 雞胚感染試驗(yàn)

將所純化病毒液接種SPF雞胚，盲傳3代，可以觀察到3代雞胚都沒(méi)有死亡。解剖第3代感染雞胚和空白對(duì)照組(未感染雞胚)，檢察雞胚各組織病理變化結(jié)果顯示，感染組雞胚發(fā)育不良，胚體蜷縮矮小，雞胚絨毛尿囊膜呈灰白色，而對(duì)照組雞胚發(fā)育正常。表明FAdV-4感染SPF雞胚能導(dǎo)致雞胚發(fā)育異常，但對(duì)雞胚致死性不強(qiáng)。收集接毒后連續(xù)傳3代的雞胚絨毛尿囊膜，提取病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示陽(yáng)性(圖5)

M.DL 2000 DNA Marker；+.FAdV-4細(xì)胞培養(yǎng)物；-.正常雞絨毛尿囊膜；1～3.FAdV-4接種1～3代雞絨毛尿囊膜圖5 SPF雞胚絨毛尿囊膜FAdV-4 PCR檢測(cè)

2.4.3 雛雞感染性試驗(yàn)

對(duì)1日齡雛雞進(jìn)行肌肉注射FAdV-4病毒液(0.2 mL/只)，感染劑量為0.2×107/mL，感染后前2 d未出現(xiàn)明顯癥狀，第3天開(kāi)始，雛雞表現(xiàn)沉郁、羽毛呈束、甩鼻、排黃色稀糞等癥狀。第4天雛雞有死亡現(xiàn)象，其剖檢主要病變可見(jiàn)心肌柔軟、心包內(nèi)有大量黃色透明液體；肝臟腫大、呈黃色、并且伴有出血點(diǎn)；其他組織器官均有不同程度的水腫；空白對(duì)照組(未攻毒雛雞)剖檢組織器官無(wú)異常。結(jié)果表明，雛雞易感染FAdV-4，有很強(qiáng)的感染風(fēng)險(xiǎn)，其病理變化均呈現(xiàn)FAdV-4典型致病特征。

采集感染雞組織樣本，應(yīng)用qPCR方法對(duì)FAdV-4含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，感染雛雞肝臟樣本中FAdV-4含量最高，其次是心包積液，心臟組織中也存在較高病毒含量，而脾臟、肺臟和腎臟中FAdV-4病毒含量低或檢測(cè)不出；正常對(duì)照組雛雞均未檢測(cè)到FAdV-4病毒核酸(圖6)。結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4主要侵害感染雛雞肝臟、心臟組織，對(duì)其他組織臟器侵害程度低。

+.FAdV-4細(xì)胞培養(yǎng)物；-.正常雛雞肝臟；1～2.肝臟；3～4.心包積液；5～6.心臟；7～8.脾臟；9～10.肺臟；11～12.腎臟圖6 組織樣本FAdV-4核酸qPCR檢測(cè)

3 討論

近年來(lái)，HPS在國(guó)內(nèi)流行范圍持續(xù)擴(kuò)大，河南、山東、河北、安徽、湖北、貴州等省份都有報(bào)道[12]，造成經(jīng)濟(jì)損失較大。各地報(bào)道致病性和毒株特征不盡相同，河北秦皇島地區(qū)分離到的毒株為禽腺病毒C群，其臨床病例均有典型癥狀，死亡率大約在20%～80%，4株分離株與標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)比進(jìn)行生物信息學(xué)分析，均有不同ORF區(qū)域缺失堿基[13]。遼寧地區(qū)臨床疑似禽腺病毒感染雞肝臟進(jìn)行病毒分離，確定分離毒為FAdV-4，和國(guó)內(nèi)毒株對(duì)比，penton、Fiber1、Fiber2基因核苷酸序列均有不同堿基突變[14]。研究資料表明，各地雞HPS病原毒株存在不同程度的變異，而毒株的差異也帶來(lái)致病性的差異。因此，本研究基于貴州省本地病例，開(kāi)展FAdV-4毒株的分離與鑒定，將有助于研究FAdV-4貴州株變異情況、致病特征和致病機(jī)理。

Ⅰ群禽腺病毒增殖最好的宿主是雞胚，但禽腺病毒Ⅱ、Ⅲ群均難在雞胚中病毒增殖[15]。目前關(guān)于禽腺病毒的分離培養(yǎng)技術(shù)有雞胚分離培養(yǎng)、細(xì)胞分離培養(yǎng)和動(dòng)物分離培養(yǎng)[16]。本試驗(yàn)對(duì)FAdV-4分離株的雞胚感染性試驗(yàn)證實(shí)，該病毒可在雞胚中增殖，但并不完全致雞胚死亡，這與梁廣成等[17]的報(bào)道相同。FAdV-4也可以在細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，但是不同的細(xì)胞對(duì)其增殖效果不同，LMH、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、雞胚腎細(xì)胞(CEK)等都可以對(duì)此病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)[18]。本試驗(yàn)應(yīng)用LMH細(xì)胞培養(yǎng)FAdV-4，顯示FAdV-4能在LMH細(xì)胞中增殖且引起明顯CPE，與陳天驁[19]用CEF、CEK增殖和分離FAdV-4相比具有一定優(yōu)勢(shì)，病毒增殖快，分離純度高。羅思思等[20]在LMH細(xì)胞中增殖且引起明顯CPE，也表明LMH細(xì)胞對(duì)FAdV-4的培養(yǎng)分離更具有優(yōu)勢(shì)。FAdV-4能夠在禽類(lèi)細(xì)胞組織中進(jìn)行增殖，并導(dǎo)致感染動(dòng)物出現(xiàn)典型的臨床癥狀[21]。本試驗(yàn)分離獲得FAdV-4貴州株感染雛雞，能引起感染雞出現(xiàn)死亡，且表現(xiàn)典型的心包積液和肝炎病理變化。

病毒的鑒定方法主要通過(guò)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)觀察、病原核酸檢測(cè)、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光技術(shù)、電鏡觀察等，分別從病原核酸、病原抗原蛋白、病毒致病性、病毒形態(tài)等多方面驗(yàn)證病毒粒子的存在和基本特征[22]。本試驗(yàn)CPE觀察、病毒粒子電鏡觀察、病原核酸檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果均提示，已成功從臨床疑似病例組織中分離獲得FAdV-4毒株，且該分離毒株能在SPF雞胚和雛雞中感染增殖，能引起雛雞死亡并出現(xiàn)典型的心包積液和肝炎的癥狀。雛雞組織樣本FAdV-4核酸定量檢測(cè)也間接反映，病毒對(duì)心臟和肝臟的侵襲性較其他臟器強(qiáng)，這與病例表現(xiàn)的臨床癥狀相吻合。研究結(jié)果為FAdV-4致病機(jī)制和疾病防治研究奠定基礎(chǔ)。