復(fù)合微生物菌劑在豬糞無害化處理中的應(yīng)用

邵栓，朱群，李慧娟，常娟，王平，劉超齊，尹清強(qiáng)*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.瑪納斯縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆 昌吉 832200；3.河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000；4.河南省鄭州種畜場(chǎng)，河南 鄭州 450011)

隨著我國(guó)畜牧業(yè)向規(guī)?；图s化的不斷發(fā)展，大量未經(jīng)處理直接排放的畜禽糞便給環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[1-3]。因此，如何加快促進(jìn)畜禽糞便無害化、減量化和資源化利用，已經(jīng)成為畜牧業(yè)發(fā)展迫切需要解決的重要問題。由于畜禽糞便中氮、磷、鉀及微量元素含量豐富，因此畜禽糞便堆肥化處理是解決畜禽糞便資源化利用的最有效途徑[4-5]。傳統(tǒng)的堆肥化處理由于堆肥周期長(zhǎng)，不能有效控制堆肥過程中產(chǎn)生的臭氣和病原菌，限制了其在規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的推廣應(yīng)用[6]。高溫好氧堆肥化處理，由于其對(duì)糞便中有機(jī)物分解速度快、最大程度地減少臭氣排放及殺滅病原菌等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前畜禽糞便資源化利用中的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容[7]。高溫好氧生物堆肥化處理是將各種堆肥原料按一定比例混合后，控制一定的堆肥條件，依靠微生物之間的相互作用,通過高溫發(fā)酵分解有機(jī)物轉(zhuǎn)變?yōu)榉柿系募夹g(shù)[8]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，在堆肥中加入功能性微生物菌劑，能相對(duì)延長(zhǎng)堆肥高溫持續(xù)時(shí)間，控制惡臭氣體的轉(zhuǎn)化，降低堆肥中的養(yǎng)分損失，改善堆肥微生物菌群組成。岳丹等[9]發(fā)現(xiàn)，有纖維素降解功能復(fù)合菌劑能降低堆肥中纖維素含量，提高豬糞堆肥期發(fā)酵溫度，縮短堆肥周期。孫旭等[10]報(bào)道，復(fù)合菌劑能顯著提高豬糞堆肥產(chǎn)品中速效氮、速效磷、速效鉀含量。徐杰等[11]發(fā)現(xiàn)，有快速升溫除臭功能的復(fù)合菌劑可以明顯降低雞糞堆肥過程中臭氣濃度，降低堆肥中氮素?fù)p失，快速有效分解纖維素等有機(jī)物質(zhì)。張生偉等[12]研究表明，與自然堆肥相比，在加入除臭功能復(fù)合菌劑的豬糞和雞糞堆肥中，氮元素?fù)p失分別降低了25.84%和28.65%，同時(shí)都能促進(jìn)硫元素向無機(jī)硫形式轉(zhuǎn)化，減少惡臭氣體排放。徐瑩瑩[13]發(fā)現(xiàn)，有木質(zhì)纖維素降解能力的復(fù)合菌劑能促進(jìn)堆肥有機(jī)質(zhì)分解，減少堆肥中反硝化細(xì)菌數(shù)量。由于糞便堆肥發(fā)酵的菌種配伍、原料組合及發(fā)酵工藝等方面存在一些問題，本試驗(yàn)通過控制堆肥含水率，選擇適宜除臭功能的微生物菌劑及發(fā)酵時(shí)間，研究其對(duì)堆肥溫度、惡臭物質(zhì)含量和微生物菌群的影響，為大規(guī)模堆肥生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬糞取自輝縣市某養(yǎng)豬場(chǎng)，輔料玉米秸稈取自養(yǎng)豬場(chǎng)周圍農(nóng)場(chǎng)，機(jī)械粉碎至2～3 cm的小段。有除臭功能的復(fù)合微生物菌劑由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備，當(dāng)各種菌濃度皆以1×109CFU/mL計(jì)算時(shí)，貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和干酪乳桿菌在糞便發(fā)酵中的添加量分別為：0.05%、0.005%、0.001%和0.1%。堆肥原料的主要理化性質(zhì)見表1。

表1 堆肥原料的主要理化性質(zhì)(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 主要試劑配制

1.2.1 納氏試劑

稱取12 g氫氧化鈉溶于60 mL水中，冷卻待用；稱取1.7 g二氯化汞溶于30 mL水中待用；稱取3.5 g碘化鉀于100 mL水中，在攪拌下緩慢加入二氯化汞溶液，直至形成紅色沉淀不再溶解為止；把氫氧化鈉溶液加入到二氯化汞和碘化鉀的混合溶液中，再加入剩余的二氯化汞溶液，混合均勻后，放于暗處?kù)o置24 h，取上清液于棕色試劑瓶中，2～5 ℃保存。

1.2.2 鉻酸鋇懸浮液

稱取19.44 g鉻酸鉀和24.44 g氯化鋇，分別溶于1 L的去離子水中，在電爐上加熱至沸騰。將兩溶液混勻倒入一個(gè)3 L大燒杯中，待生成鉻酸鋇沉淀后倒出上清液，用去離子水洗滌5次沉淀，最后用去離子水定容至1 L，每次使用前需要搖動(dòng)混勻。

1.3 堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)分組見表2。把收集的新鮮豬糞便稱取80 kg于堆肥場(chǎng)空地上，用輔料玉米秸稈調(diào)節(jié)堆體含水率后，接入制備的復(fù)合微生物菌劑，混合均勻后用塑料薄膜密封發(fā)酵。試驗(yàn)期為28 d，第1周每2 d人工翻堆1次，后續(xù)每5 d人工翻堆1次，每個(gè)處理組在堆肥環(huán)節(jié)上保持一致。

表2 堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組

1.4 樣品采集

在各堆肥體堆肥結(jié)束時(shí)，翻堆混合均勻后，在堆體四角和中心點(diǎn)各取200 g左右樣品，用四分法混合均勻后各取300 g左右裝入自封袋中，10 g左右樣品保存于4 ℃，用于測(cè)定微生物菌群和pH值指標(biāo)，250 g左右樣品保存于-20 ℃，用于測(cè)定全氮、銨態(tài)氮、硫酸鹽、吲哚和水分指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 樣品銨態(tài)氮的測(cè)定

參照HJ/T 535—2009《水質(zhì) 氨氮的測(cè)定 納氏試劑分光光度法》測(cè)定銨態(tài)氮。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以硫酸銨為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到銨態(tài)氮濃度(μg/mL)與波長(zhǎng)在420 nm下的吸光度值，建立回歸方程Y=6.991 4X-0.038 8，R2=0.990 7。式中X為波長(zhǎng)420 nm下的吸光度值，Y為銨態(tài)氮濃度(μg/mL)。

樣品銨態(tài)氮測(cè)定：稱取5 g樣品加入25 mL 1 moL/L的NaOH溶液，180 r/min搖床振蕩30 min，移至50 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，上清液即為樣品測(cè)定液，吸取適當(dāng)體積的樣品測(cè)定液，測(cè)定吸光度值。

銨態(tài)氮計(jì)算：銨態(tài)氮(mg/g)=(A×B×N/1 000)/M，其中A為樣品測(cè)定液由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得銨態(tài)氮濃度(μg/mL)，B為反應(yīng)液總體積(mL)，N為分取倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量(g)。

1.5.2 樣品硫酸鹽的測(cè)定

參照HJ/T 342—2007《水質(zhì) 硫酸鹽的測(cè)定 鉻酸鋇分光光度法(試行)》測(cè)定硫酸鹽。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以無水硫酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到硫酸鹽濃度與波長(zhǎng)在420 nm下的吸光度值的回歸方程Y=0.152 4X-0.000 7，R2=0.995 3。式中X為波長(zhǎng)420 nm下的吸光度值，Y為硫酸鹽濃度(mg/mL)。

樣品硫酸鹽測(cè)定：取5 g樣品于150 mL三角瓶中，加20 mL去離子水，180 r/min搖床振蕩4 h，靜置2 h，加1滴10%醋酸鋅溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中3 000 r/min離心5 min，上清即為測(cè)定液，吸取適當(dāng)體積的測(cè)定液測(cè)定吸光度值。

硫酸鹽計(jì)算：硫酸鹽(mg/g)=(A×B×N)/M，其中A為樣品測(cè)定液由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得硫酸鹽濃度(mg/mL)，B為反應(yīng)液總體積(mL)，N為分取倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量(g)。

1.5.3 樣品吲哚的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]的方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以吲哚為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出吲哚濃度(μg/mL)與波長(zhǎng)在525 nm下的吸光度值的回歸方程Y=0.001 7X+0.001 3，R2=0.992 4。式中Y為波長(zhǎng)525 nm下的吸光度值，X為吲哚濃度(μg/mL)。

樣品預(yù)處理：稱取糞樣5 g，加入0.1 mol/L NaOH 20 mL，振蕩30 min，在100 ℃水浴條件下處理15 min，加入12.5 mL 0.1 mol/L NaOH，混合液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，靜置30 min，上清液即為提取液。

樣品吲哚的測(cè)定：取25 mL比色管，依次加入2 g/L二苯胺磺酸鈉3 mL，1 mol/L HCl 6 mL。搖勻后加入10 g/L NaNO22.5 mL，待溶液紫色褪去后，4 ℃放置5 min。加入20 g/L氨基磺酸銨3 mL，待氣泡逸出后，加入2 mL提取液，用蒸餾水定容至刻度線。于55 ℃條件下顯色5 min，室溫放置15 min，525 nm處測(cè)定吸光度值。糞便吲哚含量=(A×V1)/(W×V2)，其中A為標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的吲哚濃度(μg/mL)，V1為提取液體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)，V2為反應(yīng)液體積(mL)。

1.5.4 其他指標(biāo)的測(cè)定

溫度的測(cè)定：堆肥期間每天12:30用數(shù)顯式溫度計(jì)分別測(cè)定每個(gè)堆體上、中和下層溫度，取3個(gè)點(diǎn)的平均值，同時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境溫度。

含水率的測(cè)定：采用105 ℃恒溫干燥法。

全碳、全氮和pH的測(cè)定：按照NY525—2012《有機(jī)肥料》標(biāo)準(zhǔn)方法。

大腸桿菌和乳酸菌的測(cè)定：用稀釋平板涂布法，大腸桿菌涂布于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上(蛋白胨10 g、乳糖10 g、磷酸氫二鉀2 g、瓊脂15 g、伊紅0.4 g、美藍(lán)0.065 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.3)，乳酸菌涂布于乳酸菌培養(yǎng)基上(蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值6.2～6.6)。37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌落數(shù)(CFU)，用自然對(duì)數(shù)(lg)表示。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行初步處理后，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA方差統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異的顯著性用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對(duì)堆肥溫度的影響

由圖1可知，在整個(gè)堆肥期，A、B、C、D和E組堆肥最高溫度分別為60、59.83、59.67、18.6和16.1 ℃，其中A、B和C組的堆體溫度顯著高于D組和E組(P<0.05)。A組50 ℃以上的堆肥溫度下共保持4 d，B和C組共保持5 d。在堆肥8～12 d和20～21 d，B組發(fā)酵溫度都高于A、C、D和E組(P<0.05)。堆肥結(jié)果顯示，B組的堆肥發(fā)酵效果相對(duì)較好。

圖1 堆肥過程中溫度的變化(n=3)

2.2 微生物菌劑對(duì)堆肥微生物菌群的影響

由表3可知，堆肥中E組大腸桿菌數(shù)量最多，B組大腸桿菌數(shù)量最少，B組大腸桿菌數(shù)量分別比D和E組減少了60.26%和62.84%(P<0.05)。B組乳酸菌數(shù)量比E組提高了14.41%(P<0.05)。

表3 微生物除臭劑對(duì)堆肥微生物菌群的影響(n=3) lg(CFU/g)

2.3 微生物菌劑對(duì)堆肥有關(guān)惡臭物質(zhì)的影響

由表4可知，A組和B組之間堆肥銨態(tài)氮的濃度差異不顯著(P>0.05)，但A、B組均顯著低于其他組(P<0.05)。B組堆肥銨態(tài)氮/全氮值最低，與A、C、D和E組相比，分別降低了19.60%(P>0.05)、31.99%(P<0.05)、42.81%(P<0.05)和58.37%(P<0.05)。B組堆肥吲哚濃度最低，與A、C、D和E組相比，分別降低了16.08%(P>0.05)、8.43%(P>0.05)、53.36%(P<0.05)和67.52%(P<0.05)。D組堆肥硫酸鹽濃度最高，與A、B和C組相比，分別提高了49.89%(P<0.05)、31.07%(P<0.05)和40.42%(P<0.05)。堆肥結(jié)果顯示，B組能最大程度地減少堆肥惡臭氣體排放，提高堆肥養(yǎng)分質(zhì)量。

表4 微生物除臭劑對(duì)堆肥惡臭組分的影響(風(fēng)干基礎(chǔ)，n=3)

3 討論

3.1 微生物除臭菌劑對(duì)堆肥溫度的影響

堆肥發(fā)酵是堆肥原料中的有機(jī)物在微生物作用下，快速分解釋放大量的發(fā)酵熱，使堆體溫度逐步升高的過程，堆肥溫度一直是評(píng)價(jià)堆肥進(jìn)程的重要物理指標(biāo)[15]。堆肥過程的溫度一般需要經(jīng)過升溫、高溫和降溫3個(gè)階段，其中高溫階段是堆肥最為關(guān)鍵的階段[15]。堆體溫度需保持在55 ℃達(dá)到3 d以上，或50 ℃達(dá)到5～7 d，是抑制堆體中病原微生物生長(zhǎng)繁殖的重要條件[16]。通過在堆肥中添加功能性微生物菌劑可相對(duì)延長(zhǎng)堆肥高溫階段持續(xù)時(shí)間，加快堆肥進(jìn)程。李天樞[17]通過在由豬糞、牛糞和玉米秸稈組成的堆肥體中添加微生物菌劑，可使堆體在55 ℃以上維持5 d。王信等[18]在牛糞堆肥中添加微生物菌劑，僅用2 d時(shí)間溫度就上升到了50 ℃，且能維持高溫階段9 d，12 d便可完成發(fā)酵。本研究在堆肥中加入由貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和干酪乳桿菌復(fù)配而成的微生物菌劑，用以提高堆肥發(fā)酵熱值，加快糞便發(fā)酵腐熟，取得了與前人一致結(jié)果。堆體水分含量是影響微生物生長(zhǎng)代謝的重要因素，堆肥初始含水率在40%～70%才能保證堆肥的順利進(jìn)行[19]。本試驗(yàn)在控制堆肥含水率為40%～60%時(shí)，加入研制的復(fù)合微生物菌劑都可使堆肥在第4天達(dá)到最高溫度，可能是因?yàn)榧尤氲木鷦┲泻癖诰T的芽孢桿菌耐熱性有關(guān)，也有可能是加入的干酪乳酸桿菌對(duì)有機(jī)質(zhì)的加速分解作用，不過溫度的變化受外界因素的影響也較大。

3.2 微生物除臭菌劑對(duì)堆肥微生物菌群的影響

糞便大腸桿菌數(shù)量常被用來作為評(píng)價(jià)糞便無害化處理的重要指標(biāo)。潘攀[20]把微生物菌劑加入堆肥體，在堆肥開始時(shí)，測(cè)得的大腸桿菌數(shù)量大約為3 ×103CFU/g，控制堆體的初始溫度在45 ℃條件下，5 d后堆體中大腸桿菌的數(shù)量已經(jīng)降到零，控制堆體初始溫度在25 ℃和35 ℃條件下，堆肥進(jìn)行8 d后堆料中己檢測(cè)不出大腸桿菌。Turner[21]對(duì)堆肥中標(biāo)記的大腸桿菌滅活所需的溫度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，超過55 ℃約2 h才能使大腸桿菌滅活。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在堆肥結(jié)束時(shí)都能檢測(cè)到大腸桿菌的存在，但在加入秸稈調(diào)節(jié)堆體初始水分含量為50%左右的B組大腸桿菌數(shù)量顯著低于其他組。造成這種結(jié)果的原因可能是堆體維持的高溫期時(shí)間較短，不能完全使堆體中的大腸桿菌滅活，由于B組高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于其他組，使得檢測(cè)到的大腸桿菌數(shù)量顯著低于其他組，也說明了溫度對(duì)大腸桿菌滅活的影響。

3.3 微生物除臭菌劑對(duì)堆肥惡臭組分的影響

畜禽糞便中含有大量的未被消化吸收的蛋白質(zhì)，其在一系列微生物的作用下產(chǎn)生大量的含氮臭氣，糞便堆肥過程中，有機(jī)氮的礦化、NH3的持續(xù)性揮發(fā)以及硝態(tài)氮的反硝作用是導(dǎo)致大量氮損失的重要原因，堆體銨態(tài)氮/全氮值的高低可以間接反應(yīng)含氮化合物相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系，銨態(tài)氮/全氮比值越低，堆體沉積的氮就越多[22]。堆肥過程中氮的形態(tài)包括總氮、有機(jī)氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，氮的轉(zhuǎn)化途徑主要有氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固定作用，大部分的揮發(fā)性氮素是在氮轉(zhuǎn)化細(xì)菌對(duì)含氮有機(jī)物降解過程中產(chǎn)生的，主要有氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和自生固氮細(xì)菌[13]。在堆肥中加入微生物菌劑成為減少肥料氮損失的重要方法，張生偉[23]將微生物除臭劑加入豬糞和雞糞堆肥中，發(fā)現(xiàn)微生物除臭劑不僅有良好的除臭效果，而且減少了豬糞和雞糞堆肥中25.84%和28.65%的氮元素?fù)p失。本研究發(fā)現(xiàn)，在豬糞堆肥中加入微生物菌劑，可相對(duì)減少總氮、銨態(tài)氮濃度、銨態(tài)氮/全氮比值，說明菌劑中優(yōu)勢(shì)微生物直接參與氮的轉(zhuǎn)化，或通過與氮轉(zhuǎn)化細(xì)菌的交互作用影響氮的代謝。

H2S和硫醇是含硫有害氣體的主要成分，糞便中有機(jī)含硫化合物通過硫轉(zhuǎn)化細(xì)菌的作用釋放出含硫氣體，H2S由于化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，可被硫氧化細(xì)菌氧化為硫酸鹽，糞便中的硫酸鹽和硫酸根在厭氧條件下通過硫酸鹽還原細(xì)菌的活動(dòng)是產(chǎn)生硫化氫的主要途徑[24]。將微生物除臭劑加入豬糞和雞糞堆肥，在堆肥結(jié)束時(shí)與自然堆肥相比，加入微生物除臭劑的堆肥硫酸鹽含量顯著高于自然堆肥，并減少了含硫氣體的排放[23]。糞便中的蛋白質(zhì)在一些腐敗微生物的作用下被分解產(chǎn)生L-色氨酸，進(jìn)一步分解產(chǎn)生吲哚，吲哚與糞便臭味的產(chǎn)生有密切關(guān)系[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在堆肥硫酸鹽上，B組堆體硫酸鹽含量高于A組和C組，說明B組在降低H2S排放方面要優(yōu)于A組和C組；在吲哚的形成上，B組也顯著低于A組和C組。造成上述結(jié)果的原因可能是由于B組堆體水分含量適中，有利于優(yōu)勢(shì)微生物的生長(zhǎng)代謝，一方面優(yōu)勢(shì)微生物可以利用一部分惡臭物質(zhì)，另一方面優(yōu)勢(shì)微生物可以抑制惡臭物質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)菌的代謝活動(dòng)，進(jìn)而抑制有機(jī)質(zhì)向惡臭物質(zhì)轉(zhuǎn)化，為畜禽糞污的無害化處理和資源化利用奠定了基礎(chǔ)。