楊木屑酶解液作為碳源制備細(xì)菌纖維素的條件優(yōu)化

（山東恒誠(chéng)檢測(cè)科技有限公司 山東 250000）

1.材料與方法

(1)菌株

木醋桿菌。菌株。山東省微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

(2)主要試劑

葡萄糖（北京陸橋），蛋白胨（北京陸橋），酵母粉（北京陸橋），無(wú)水磷酸氫二鈉（國(guó)藥集團(tuán)，檸檬酸一水化合物（國(guó)藥集團(tuán)）。

(3)主要儀器

天平、高壓蒸汽滅菌器、生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱。

(4)培養(yǎng)基

楊木屑酶解液的預(yù)處理：將楊木屑與蒸餾水按1:20混合加入，調(diào)節(jié)pH為6，加入纖維素酶液和半纖維素酶液，混合均勻，50℃水浴條件下加熱的時(shí)間5h。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5g，無(wú)水磷酸氫二鈉0.5g，檸檬酸一水化合物0.5g。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，楊木屑酶解液100（ml/L），蛋白胨5g，酵母粉5g，無(wú)水磷酸氫二鈉2.4g，檸檬酸一水化合物1.0g，pH6。

(5)產(chǎn)量的測(cè)定

用鑷子取出靜置培養(yǎng)數(shù)天后培養(yǎng)基表面形成的細(xì)菌纖維素，在蒸餾水中小心沖洗數(shù)次，直到細(xì)菌纖維素表面的菌落和培養(yǎng)基洗凈，然后將洗干凈的細(xì)菌纖維素濕膜放入含有0.1mol/L的NaOH溶液的燒杯中，在90℃條件下水浴加熱2h。然后取出細(xì)菌纖維素濕膜繼續(xù)用蒸餾水沖洗數(shù)次，至中性。最后用分析天平稱重。

(6)單因素法優(yōu)化產(chǎn)酶條件

①不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

將種子液不同接種量分別接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，然后測(cè)定細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，篩選出最佳接種量。

②不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基（其他成分同基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基），其他條件保持不變。

③不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在上述優(yōu)化條件下，將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基上，其他條件保持不變。

④培養(yǎng)基的不同初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的無(wú)水磷酸氫二鈉和檸檬酸一水化合物培養(yǎng)基（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉采用最佳濃度，其他成分同基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基），并調(diào)節(jié)至不同的初始pH，其他條件保持不變。

⑤發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分，在不同的溫度下靜置培養(yǎng)，其他條件保持不變。

⑥發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分，在最佳發(fā)酵溫度下靜置培養(yǎng)不同的時(shí)間，然后測(cè)定細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

(1)不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在上述條件下，接種量按照體積比分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%進(jìn)行接種，結(jié)果見(jiàn)圖1，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著接種量的增加不斷升高，當(dāng)接種量達(dá)到5%時(shí)，產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，因此選用5%作為最佳接種量。

圖1 不同接種量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

(2)不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在最佳接種量的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著葡萄糖濃度的增加先增加后下降，當(dāng)濃度在15g/L時(shí)，產(chǎn)量最高，因此選用15g/L作為最佳葡萄糖濃度。

圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

(3)不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在最佳接種量、最佳葡萄糖濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著蛋白胨濃度的增加先增加后下降，當(dāng)濃度在7.5g/L時(shí)，產(chǎn)量最高。

細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著酵母粉濃度的增加先增加后下降，當(dāng)濃度在7.5g/L時(shí)，產(chǎn)量最高，因此選用7.5g/L作為最佳酵母粉濃度。

圖3 不同濃度蛋白胨和酵母粉對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

(4)培養(yǎng)基的不同初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖4 不同初始發(fā)酵pH對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

在最佳接種量、最佳葡萄糖、蛋白胨、酵母粉濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著初始pH的增加先增加后下降，當(dāng)pH為5.5時(shí)，產(chǎn)量最高，因此選用無(wú)水磷酸氫二鈉2.1g，檸檬酸一水化合物1.2g，調(diào)節(jié)pH至5.5作為最佳初始發(fā)酵pH。

(5)發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

選用最佳培養(yǎng)基成分，在不同的溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）下靜置培養(yǎng)6d進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的增加先增加后急劇下降，發(fā)酵溫度30℃時(shí)，仍然產(chǎn)量最高，因此30℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

3.結(jié)論

到目前為止，細(xì)菌纖維素的合成產(chǎn)量一直受各種因素的影響，而優(yōu)化其發(fā)酵條件是目前主要的研究方向，這對(duì)于中式生產(chǎn)或工業(yè)生產(chǎn)具有重要的借鑒意義。

本文通過(guò)單因素法，對(duì)一株木醋桿菌利用楊木屑合成細(xì)菌纖維素的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g，酵母粉7.5g，無(wú)水磷酸氫二鈉2.2g，檸檬酸一水化合物1.2g，pH5.5，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間5d的發(fā)酵條件，其產(chǎn)量較優(yōu)化前調(diào)高了近1倍。