氧化飼糧中添加果膠寡糖對斷奶大鼠空腸與肝臟組織形態(tài)和抗氧化能力的影響

王 旭 毛湘冰 孫 銳 范祥奇 余 偉 豆屹松

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都611130)

作為畜牧生產(chǎn)大國，我國的飼料年總產(chǎn)量超2億t。由于受到光照、溫度、濕度、微生物等的影響，飼料往往會出現(xiàn)不同程度的氧化酸敗。而這些氧化酸敗飼糧會對動物的生長性能、免疫能力和抗氧化能力造成很多不良影響。已有的大量研究表明，陳化飼料或飼糧中使用氧化油脂會降低動物的生長性能，并導致動物機體的抗氧化能力受損，發(fā)生氧化應激[1-4]。

果膠寡糖(pectic oligosaccharide,POS)是果膠經(jīng)過解聚作用后形成的一類穩(wěn)定性好、耐熱性好及甜度低的糖類化合物(主要成分是果膠二糖和果膠三糖)，但其并不能被人體和動物的消化系統(tǒng)消化吸收，而是被腸道微生物利用進而發(fā)揮作用[5]。近年來的研究表明，果膠寡糖具有諸多生理功能，如提高機體的抗氧化能力、改善腸道健康、調(diào)節(jié)脂類代謝、提高機體免疫等[6-8]。針對其抗氧化能力的研究表明，果膠寡糖在體內(nèi)和體外均具有抗氧化作用。杜麗娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山楂果膠寡糖對超氧自由基、羥自由基和二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基均表現(xiàn)出了很強的清除作用。本課題組前期試驗也表明，飼糧添加蘋果果膠寡糖可顯著提高斷奶大鼠血清和斷奶仔豬腸道的抗氧化能力，并可緩解輪狀病毒攻毒誘導的仔豬腸道中抗氧化能力下降[7,10]。因此，本研究擬探討氧化飼糧中添加果膠寡糖是否可改善斷奶大鼠生長性能、空腸和肝臟組織結構及抗氧化能力，以期進一步完善果膠寡糖提高機體抗逆性的可能機制，這將為果膠寡糖在畜禽生產(chǎn)上的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

果膠寡糖：購自河北某生物技術有限公司，由蘋果果膠通過酶解而來，有效成分(果膠二糖和果膠三糖)含量>30%，其他成分為輔料(玉米淀粉)。

1.2 試驗動物與設計

試驗選取18只健康的雄性3周齡斷奶Wistar大鼠(成都達碩實驗動物有限公司提供)，按體重相近原則隨機分為3組，即對照組、氧化飼糧組和氧化飼糧補充果膠寡糖組，分別飼喂正常飼糧、氧化飼糧和添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧，每組6個重復，每個重復1只大鼠。試驗期為21 d。試驗在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所教學試驗基地完成，試驗大鼠采用單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)管理，自然采光、通風，自由采食、飲水。

試驗基礎飼糧采用AIN-93G鼠純合飼糧標準，交由成都達碩實驗動物有限公司配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。添加果膠寡糖的飼糧是以200 mg/kg果膠寡糖等量替代基礎飼糧中玉米淀粉配制而成。氧化飼糧和添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧為2019年5月配制，常溫保存；正常飼糧為2020年5月配制。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 飼糧的氧化程度和黃曲霉毒素B1含量檢測

測定各組飼糧的酸價(acid value,AV)和過氧化物值(peroxide value,POV)，具體方法分別參考《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》(GB 5009.229—2016)和《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》(GB 5009.227—2016)，用于表示飼糧的氧化程度；各組飼糧中黃曲霉毒素B1含量采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELIAS)方法進行測定，試劑盒購于百奧森(江蘇)食品安全科技有限公司。

1.3.2 果膠寡糖的體外抗氧化活性

果膠寡糖的總還原能力和對DPPH自由基清除率具體測定方法參考鐘偉萍[11]進行。果膠寡糖對2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS+]自由基清除率采用上海碧云天生物技術有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定，具體測定方法參照試劑盒說明書。所有指標均以維生素C作為陽性對照，并設空白對照。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)代謝能 Metabolizable energy/(MJ/kg)16.62粗蛋白質(zhì) Crude protein18.70纖維素 Fiber 5.00粗脂肪 Crude fat 7.00碳水化合物Carbohydrate 64.70

1.3.3 生長性能

每日記錄采食量，于試驗第1和22天對所有大鼠進行空腹稱重，用于計算體增重和采食量。

1.3.4 樣品采集

試驗第22天稱重后，對所有大鼠進行乙醚麻醉，屠宰。迅速分離肝臟和空腸，于相同部位取組織塊于4%多聚甲醛中固定，并取組織塊分裝于凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃保存。

1.3.5 空腸和肝臟組織病理觀察

空腸和肝臟組織石蠟切片的制作參考Mao等[10]的方法進行。對空腸和肝臟組織切片進行照相，分析和記錄組織的病理變化。

1.3.6 空腸和肝臟抗氧化指標

樣品前處理方法：取0.1 g左右(分析天平稱量精確至0.001 g)空腸或肝臟組織樣品于2 mL的EP管中，按組織∶預冷生理鹽水=1∶9(質(zhì)量體積比)的比例加入預冷生理鹽水，在勻漿機中充分勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清，用于抗氧化指標的測定。

空腸和肝臟組織樣品中總蛋白與丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，具體測定方法參照試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)采用Excel 2013進行初步整理后，大鼠生長性能和臟器抗氧化能力數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，處理間差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較；果膠寡糖與維生素C的體外抗氧化能力數(shù)據(jù)以每個劑量進行t檢驗。當P<0.05時，表明差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 飼糧的氧化程度和霉變情況

從表2中可以看出，與正常飼糧相比，經(jīng)過1年常溫存儲的氧化飼糧和添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧的酸價和過氧化值均升高；而與氧化飼糧相比，添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧的酸價和過氧化值均有不同程度的降低。關于飼糧的霉變情況，通過觀察，本試驗開始前各組飼糧(包括2個長期存放的氧化飼糧)均未出現(xiàn)霉變；而各組飼糧中黃曲霉毒素B1含量的檢測結果顯示，其含量均低于1 μg/kg。這些可在一定程度上說明本試驗使用的3種飼糧并未發(fā)生霉變。

表2 3種飼糧中酸價和過氧化值

2.2 果膠寡糖的體外抗氧化活性

從圖1中可以看出，在體外研究中，維生素C表現(xiàn)出了極強的總還原能力、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力，而果膠寡糖表現(xiàn)出的總還原能力和DPPH自由基清除能力并不明顯，僅表現(xiàn)出對ABTS+自由基具有一定的清除能力。

圖1 果膠寡糖的體外抗氧化活性

2.3 氧化飼糧中添加果膠寡糖對斷奶大鼠生長性能的影響

從表3中可以看出，與對照組大鼠相比，氧化飼糧組大鼠的體增重和采食量顯著降低(P<0.05)；而添加果膠寡糖可以顯著緩解氧化飼糧引起的大鼠體增重和采食量下降(P<0.05)。

表3 氧化飼糧中添加果膠寡糖對斷奶大鼠生長性能的影響

2.4 氧化飼糧中添加果膠寡糖對斷奶大鼠空腸與肝臟組織形態(tài)的影響

從圖2和圖3可以看出，對照組大鼠空腸和肝臟組織形態(tài)結構正常；氧化飼糧組大鼠空腸黏膜淺層可見黏膜上皮壞死，部分黏膜上皮脫落，腸腺內(nèi)可見病理性核分裂，黏膜下層可見輕度淋巴細胞浸潤，肝血竇淤血，中央靜脈輕度淤血；氧化飼糧補充果膠寡糖組大鼠空腸黏膜輕度壞死，肝臟中央靜脈輕度淤血。由此可見，氧化飼糧的飼喂會導致空腸和肝臟嚴重的病理變化，而果膠寡糖的添加可在一定程度上緩解空腸和肝臟病變的發(fā)生。

A:對照組；B:氧化飼糧組；C:氧化飼糧補充果膠寡糖組。表3同。

圖3 大鼠肝臟組織形態(tài)

2.5 氧化飼糧中添加果膠寡糖對斷奶大鼠肝臟和空腸抗氧化指標的影響

從表4中可以看出，與對照組大鼠相比，氧化飼糧組大鼠空腸和肝臟中T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；果膠寡糖的添加顯著緩解了氧化飼糧導致大鼠空腸和肝臟中T-AOC和T-SOD活性的下降及MDA含量的上升(P<0.05)，但對GSH-Px活性無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

飼料氧化酸敗會產(chǎn)生酮、醛等有異味的化合物，造成飼料哈變，降低飼料適口性，影響采食量，嚴重的會造成動物中毒，甚至死亡。大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化飼糧不僅會降低動物的生長性能，同時還會對動物機體抗氧化性能、生物膜完整性以及機體免疫功能產(chǎn)生不良影響[12-15]。袁施彬等[2]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加氧化魚油顯著降低了肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px活性，升高了MDA含量，且降低了斷奶仔豬的生長性能和養(yǎng)分利用率。本試驗中，對斷奶大鼠飼喂長期常溫存放的飼糧，且飼糧中酸價和過氧化值大幅提高(且已超過了相關標準)，用以模擬實際生產(chǎn)中氧化飼糧對動物機體的影響。試驗結果表明，飼喂斷奶大鼠氧化飼糧顯著降低了其采食量和體增重，導致了空腸和肝臟組織的病變，并顯著影響了大鼠空腸和肝臟的抗氧化能力，誘導了氧化應激。這些結果與前人的相關研究結果[2,12-15]一致，因此，本試驗成功構建了飼喂氧化飼糧損傷大鼠生長和健康的模型。

表4 氧化飼糧中添加果膠寡糖對斷奶大鼠肝臟和空腸抗氧化指標的影響

近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加果膠寡糖可提高動物的生長性能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加蘋果果膠寡糖可提高斷奶大鼠和斷奶仔豬(甚至是輪狀病毒攻毒仔豬)的生長性能[7,10]。而本試驗結果也表明，添加200 mg/kg的果膠寡糖能顯著緩解氧化飼糧誘導斷奶大鼠采食量和體增重的下降。機體生長的變化與其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用有關，而腸道和肝臟是機體攝入營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和代謝的主要器官，因此，本試驗對大鼠的空腸和肝臟組織結構進行了觀察。相關的結果表明，盡管飼喂添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧的大鼠的空腸和肝臟組織仍存在一定病變，但與飼喂氧化飼糧的大鼠的空腸和肝臟組織相比，病變程度得到明顯緩解。

氧化還原狀態(tài)是機體(包括器官、組織和細胞)健康的重要基礎[16]。果膠寡糖具有提高機體抗氧化能力的作用。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼糧中山楂果膠寡糖的添加能顯著降低小鼠血清中MDA含量，提高血清中T-SOD活性。本課題組前期的研究表明，飼糧添加蘋果果膠寡糖可以提高大鼠血清抗氧化能力[7]，并緩解輪狀病毒攻毒誘導的仔豬腸道中抗氧化能力下降[10]。而本試驗得到了類似的結果，即果膠寡糖的添加顯著緩解了氧化飼糧對斷奶大鼠空腸和肝臟抗氧化能力(包括T-AOC、T-SOD活性和MDA含量)的負面影響。那么，可以推測，果膠寡糖改善氧化飼糧誘導空腸和肝臟組織損傷與其改善機體的抗氧化能力有關。

除了刺激機體提高抗氧化能力外，果膠寡糖本身也具有抗氧化活性。杜麗娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山楂果膠寡糖對超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基均表現(xiàn)出了很強的清除能力。丁鵬等[17]對黑莓果膠寡糖的研究發(fā)現(xiàn)，其對DPPH自由基和ABTS+自由基有很強的清除能力。本試驗使用的果膠寡糖來源于蘋果，對其總還原能力及DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力的檢測結果表明，來源于蘋果的POS的總還原能力僅為相同劑量維生素C的5.88%～9.27%，對DPPH自由基的清除能力僅為相同劑量維生素C的3.13%～11.46%，對ABTS+自由基的清除能力為相同劑量維生素C的66.67%～81.72%。這些結果表明，本試驗所用果膠寡糖(來源于蘋果)表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，但僅對ABTS+自由基表現(xiàn)出較強的清除能力，其總還原能力和對DPPH自由基的清除能力較弱。與前人的研究結果存在差異的原因可能在于果膠寡糖的來源不同。根據(jù)果膠寡糖表現(xiàn)出的一定抗氧化活性，可以在一定程度上解釋添加果膠寡糖的氧化飼糧過氧化值和酸價低于氧化飼糧。鑒于前人的研究結果發(fā)現(xiàn)，果膠寡糖還具有調(diào)節(jié)脂類代謝、免疫等營養(yǎng)生理功能，而這些功能是否在緩解氧化飼糧誘導機體損傷中發(fā)揮了作用，還有待于進一步研究。

4 結 論

盡管未完全緩解氧化飼糧對大鼠的影響，但添加果膠寡糖在一定程度上改善了斷奶大鼠的生長性能，而這可能源于果膠寡糖通過提高機體抗氧化能力改善氧化飼糧對大鼠肝臟和空腸組織結構的破壞。