血根堿通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的仔豬小腸黏膜上皮細胞炎癥反應(yīng)

高 歡 蔣曉旭* 楊玉婷 冉津銘 沈麗艷 蔣恒鑫 李雪艷 林秋葉 蔣慶文 曹振輝** 潘洪彬**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)重點實驗室，昆明650201；2.達州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，達州635000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)香料研究所，昆明650201)

養(yǎng)豬業(yè)在我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。仔豬是現(xiàn)代化養(yǎng)豬生產(chǎn)的核心，其健康狀況對后期的生長發(fā)育具有極其重要的影響[2]。其中，腸道健康是仔豬生長發(fā)育和快速生長的基礎(chǔ)[3]。天然植物及其提取物作為飼料添加劑具有來源天然和不易產(chǎn)生耐藥性的特點，同時又具有促進畜禽生長、提高免疫力、抗應(yīng)激、改善腸道健康的作用。

博落回可用于治療疥癬、陰道滴蟲及殺蟲滅蛆等，最早記載于唐人陳藏器撰寫的《本草拾遺》中[4]。從博落回中分離得到的血根堿(sanguinarine，SG)是一種苯菲啶異喹啉生物堿，具有抗炎、抑菌、提高機體免疫力、改善腸道健康等功能[5-7]。SG作為飼料添加劑可部分替代抗生素，且SG的吸收快、分布快、代謝快，生物利用度較低，機體殘留量少[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)SG使雞小腸中CD3細胞數(shù)量減少，黏膜損傷減輕，從而有助于預(yù)防腸道細菌感染[11]。肉雞飼糧中添加SG可提高肉雞的生長性能[12]。斷奶仔豬飼糧中添加SG可提高仔豬空腸和回腸絨毛高度，改善腸黏膜形態(tài)，提高小腸黏膜免疫功能，從而提高仔豬的平均日增重和平均日采食量[13-14]。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是細胞核內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它在許多細胞刺激介導(dǎo)的細胞信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用。NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄亞基包括p65、p50、p52、RelB和c-Rel，所有成員間可形成同源或異源二聚體，在細胞中主要以p50/p65二聚體形式存在，其中p65亞基含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[15-16]。NF-κB介導(dǎo)的信號通路參與體內(nèi)多種反應(yīng)過程，被認為是經(jīng)典的炎癥相關(guān)信號通路[17]。目前，SG影響仔豬腸道炎癥的作用機制尚不清楚。因此，本研究提出SG通過NF-κB信號通路調(diào)控仔豬小腸黏膜上皮細胞(IPEC-J2細胞)抗炎功能的設(shè)想，旨在闡明SG通過抑制NF-κB信號通路減輕IPEC-J2細胞炎癥的分子機制，以期為SG作為豬用飼料添加劑調(diào)控仔豬腸道健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SG，分子式為C20H14NO4，相對分子質(zhì)量為332.33，含量為99.7%，購自上海源葉生物科技有限公司；IPEC-J2細胞購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；過硫酸胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胰蛋白酶購自Biological公司；白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自上海羽朵生物有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α、p65、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)抗體購自Cell Signaling Technology公司；β-肌動蛋白(ACTB)購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計與分組

首先采用單因素試驗設(shè)計，研究SG對IPEC-J2細胞促生長作用的適宜濃度和時間以及構(gòu)建IPEC-J2細胞致炎模型LPS的適宜濃度和時間。首先，以不同濃度(0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/mL)SG處理IPEC-J2細胞24 h，研究其對IPEC-J2細胞活性的影響；并進一步研究0.500 μg/mL SG下不同時間(0、8、16、24、32、40 h)對IPEC-J2細胞活性的影響。其次，以不同濃度(0、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL)LPS處理IPEC-J2細胞24 h，研究其對IL-6、IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清中IL-6、IL-8含量的影響；并進一步研究5.0 μg/mL LPS下不同時間(1、3、6、9、12 h)對IPEC-J2細胞IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清中IL-8含量的影響。

在確定SG對IPEC-J2細胞的適宜濃度、時間和構(gòu)建LPS對IPEC-J2細胞致炎模型的基礎(chǔ)上[18-20]，分別檢測對照組(無添加)、LPS致炎模型細胞組(LPS組，5.0 μg/mL LPS處理1 h)和適宜濃度SG+LPS致炎模型細胞組(SG+LPS組，5.0 μg/mL LPS處理1 h和0.500 μg/mL SG處理24 h)在NF-κB信號通路中相關(guān)基因和蛋白表達及其產(chǎn)物含量。

1.2.2 IPEC-J2細胞培養(yǎng)

IPEC-J2細胞采用含5 mL培養(yǎng)基(含0.1%青鏈霉素抗體、10%FBS和90%DMEM高糖培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿(25 cm2)培養(yǎng)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱，2 d傳代1次。

1.2.3 細胞活性檢測

臺盼藍染色計數(shù)法：取對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，PBS清洗2～3次，胰蛋白酶消化4～6 min；加入含血清與雙抗的培養(yǎng)基3～4 mL懸浮細胞，充分混勻，靜置待用；取200 μL的細胞液和200 μL的臺盼藍進行充分混勻，混合液靜置；使用細胞計數(shù)板前需用酒精棉球進行清理，取10 μL的混合液打入細胞計數(shù)板，選取細胞計數(shù)板上四個角的方格進行計數(shù)，并取平均值。

1.2.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中豬的ACTB、IL-8、IL-6、核轉(zhuǎn)錄因子-κB1(NF-κB1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB2(NF-κB2)、RelB、核轉(zhuǎn)錄因子-κB亞基1(NF-κB1A)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB激酶抑制劑ε(IKKε)、腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)相關(guān)基因序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

1.2.5 mRNA表達量測定

實時熒光定量PCR體系見表2。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃變性30 s，反應(yīng)40個循環(huán)。

表2 實時熒光定量PCR體系

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試驗

按照IL-6、IL-8和TNF-α的ELISA檢測試劑盒操作步驟進行檢測。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

分別提取IPEC-J2細胞總蛋白、胞漿蛋白和核蛋白。采用10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。將膜用TBS-吐溫20(TTBS)中漂洗，漂洗后用5%脫脂奶封閉1 h。分別用IκBα、p65一抗4 ℃孵育過夜，ACTB作為內(nèi)參，選用HRP標記的羊抗鼠抗體4 ℃孵育2 h，暗室曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較，各組數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SG對IPEC-J2細胞活性的影響

2.1.1 不同濃度SG對IPEC-J2細胞活性的影響

由圖1可見，1.000和2.000 μg/mL的SG處理IPEC-J2細胞24 h，細胞明顯皺縮和死亡(圖1-E～圖1-F)，0～0.500 μg/mL的SG處理IPEC-J2細胞24 h后細胞形態(tài)無明顯變化(圖1-A～圖1-D)。由表3可見，2和4倍稀釋條件下，與0 μg/mL SG組相比，1.000和2.000 μg/mL SG組的細胞數(shù)量顯著或極顯著減少(P<0.01)，0.500 μg/mL SG組細胞數(shù)量極顯著增加(P<0.01)。

2.1.2 0.500 μg/mL SG處理不同時間對IPEC-J2細胞活性的影響

由表4可見，與0 h時相比，IPEC-J2平均細胞數(shù)量在16、24、32、40 h時極顯著升高(P<0.01)，且在24 h時達到最高值。

A～F的SG濃度分別為：0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/mL。

2.2 LPS對IPEC-J2細胞IL-6、IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清中IL-6、IL-8含量的影響

2.2.1 不同濃度LPS對IPEC-J2細胞IL-6、IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-6、IL-8含量的影響

由圖2可見，與0 μg/mL LPS組相比，1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL LPS組IPEC-J2細胞IL-6 mRNA相對表達量極顯著上調(diào)(P<0.01)，1、5、25 μg/mL LPS組IL-8 mRNA相對表達量顯著或極顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，且5 μg/mL LPS組IL-6、IL-8 mRNA相對表達量最高。不同濃度LPS組細胞上清液中IL-6、IL-8含量均高于對照組，5 μg/mL LPS組細胞上清液中IL-6和IL-8含量極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.2.2 5 μg/mL LPS處理不同時間對IPEC-J2細胞IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-8含量的影響

由圖3可見，5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1、3、6 h的IL-8 mRNA相對表達量均極顯著高于0 h(P<0.01)，5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1 h時細胞上清液中IL-8含量極顯著高于0 h(P<0.01)，且5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1 h時IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-8含量最高。

表3 不同濃度SG對IPEC-J2細胞24 h活性的影響

表4 0.5 μg/mL的SG在不同時間對IPEC-J2細胞活性的影響

2.3 SG對IPEC-J2細胞NF-кB信號通路的影響

2.3.1 SG對IPEC-J2細胞NF-кB信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

由圖4可見，與對照組相比，LPS組細胞中IL-6、IL-8、NF-кB1A、NF-кB2、TNFAIP3、IKKε、NF-кB1、RelBmRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞中IL-6、NF-кB1A、NF-кB2、TNFAIP3、IKKε、NF-кB1 mRNA相對表達量均極顯著降低(P<0.01)，IL-8 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖3 5 μg/mL LPS處理不同時間對IPEC-J2細胞IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-8含量的影響

圖4 SG對IPEC-J2細胞NF-κB信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

2.3.2 SG對IPEC-J2細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α含量的影響

由圖5可見，與對照組相比，LPS組細胞上清液中IL-6、IL-8含量均極顯著升高(P<0.01)，細胞上清液中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞上清液中IL-6、IL-8含量顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

圖5 SG對IPEC-J2細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量的影響

2.3.3 SG對IPEC-J2細胞中p65和IκBα蛋白表達量的影響

2.3.3.1 SG對IPEC-J2細胞總蛋白中p65和IκBα蛋白表達量的影響

由圖6可見，與對照組相比，LPS組細胞總蛋白中IκBα、p65蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞總蛋白中的IκBα蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。

2.3.3.2 SG對IPEC-J2細胞核蛋白中p65蛋白表達量的影響

由圖7可見，與對照組相比，LPS組細胞核蛋白中p65蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞核蛋白中p65蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)。

圖6 SG對IPEC-J2細胞總蛋白中p65、IκBα蛋白表達量的影響

圖7 SG對IPEC-J2細胞核蛋白中p65

2.3.3.3 SG對IPEC-J2細胞胞漿蛋白中p65蛋白表達量的影響

由圖8可見，與對照組相比，LPS組胞漿蛋白中p65蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組胞漿蛋白中p65蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。

圖8 SG對IPEC-J2細胞胞漿蛋白中p65

3 討 論

博落回提取物的主要有效成分SG早在1999年經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準可作為飼用添加劑[21]。以SG為主要成分的博落回提取物開發(fā)注冊為二類新中獸藥[(2011)新獸藥證字34號)]，并獲得了獸藥添字批準文號[獸藥添字(2012)180415250]，2019年12月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織修訂的《藥物飼料添加劑品種目錄及使用規(guī)范》依然將博落回提取物作為藥物飼料添加劑使用，成為飼料添加劑抗生素替代產(chǎn)品之一[22]。博落回提取物主要有效物質(zhì)SG顯著影響豬的增重、飼料轉(zhuǎn)化率[23]，其與益生菌聯(lián)合應(yīng)用具有預(yù)防肉雞壞死性腸炎的作用[24]。SG具有抑菌、抗炎、促生長、抗寄生蟲等多種生物活性，適用于雞、豬、魚的健康養(yǎng)殖，對我國養(yǎng)殖業(yè)和國民食品安全具有重要意義[7,25-26]。

SG在體內(nèi)外均有明顯的抗炎作用，可減輕豬腸黏膜損傷，有助于預(yù)防腸道細菌感染[27]，同時SG具有減少仔豬腸上皮細胞的水分流失和/或增強腸道水分和營養(yǎng)素吸收的功能[28]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的SG對于細胞生長具有抑制作用，SG終濃度為5～10 μmol/L時可明顯降低人乳腺癌MCF-7細胞存活率，并升高細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8、Caspase-9活性[29]。通過SG對IPEC-1細胞增殖影響的研究表明，0.25～4.00 μg/mL的SG對IPEC-1細胞的增殖有顯著的抑制作用；而0.006 25～0.100 000 μg/mL的SG對IPEC-1細胞的增殖具有顯著的促進作用，由此可見，低濃度的SG具有促進IPEC-1細胞增殖的作用[30]。本研究以0.5 μg/mL SG處理IPEC-J2細胞24 h后細胞數(shù)量達到最高值，表明SG對IPEC-J2細胞促生長作用的適宜濃度和時間分別為0.500 μg/mL和24 h。該結(jié)果的差異可能是不同細胞株對SG的耐受性不同所導(dǎo)致。

LPS作為一種典型腸毒素可引起豬產(chǎn)生細菌感染癥狀，是研究豬腸道炎癥反應(yīng)的常用藥物[31]。本研究以5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1 h，IL-8 mRNA相對表達量最高，表明構(gòu)建IPEC-J2細胞致炎模型LPS的適宜濃度和時間分別為5.0 μg/mL和1 h。

NF-кB信號通路是經(jīng)典的炎癥相關(guān)通路，激活后的NF-кB進入細胞核，與DNA模塊上的特異蛋白結(jié)合，指示細胞形成具有炎癥功能的蛋白復(fù)合物，最后這些蛋白激活炎癥并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[32-33]。其活化途徑是由LPS和致炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、細菌感染等觸發(fā)，細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，將侵襲信號傳遞給免疫細胞，誘導(dǎo)NF-κB表達增加，刺激因子產(chǎn)生的白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8和TNF-α等細胞因子與受體結(jié)合，信號傳導(dǎo)至核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白激酶(IKK)復(fù)合物，從而激活炎癥反應(yīng)[34]。IKK復(fù)合物一旦激活，IκB在絲氨酸(Ser)32和Ser36位被磷酸化[35]，并通過26S蛋白酶體被降解，NF-κB二聚體從IκB/p50/p65復(fù)合物中解離，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核中，與核內(nèi)多種靶基因的啟動子區(qū)結(jié)合，活化的NF-κB可調(diào)節(jié)細胞因子(IL-6、IL-8和TNF-α等)、細胞黏附分子和抗原遞呈細胞表面主要組織相容性復(fù)合物-Ⅱ(MHC-Ⅱ)協(xié)同刺激因子的表達，還可刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase，iNOS)和其自身抑制物IкBα的表達[36]。研究表明，活化的NF-κB引起的炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致腸黏膜損傷[37]。所以，NF-κB活化是引起腸道黏膜損傷的關(guān)鍵生理因子。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，中國鉤吻中生物堿-鉤吻堿子可抑制NF-κB活化，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)[38]。本研究中SG+LPS組細胞中NF-κB1A、IKKε、NF-κB1等mRNA相對表達量及IL-6、IL-8含量顯著或極顯著低于LPS組，表明SG通過抑制IPEC-J2細胞炎癥模型的NF-κB信號通路相關(guān)基因表達，減少IL-6、IL-8的分泌，減輕腸上皮細胞炎癥損傷，降低了IPEC-J2細胞炎癥癥狀。

在正常情況下，NF-κB位于細胞胞漿內(nèi)，一般有2個功能亞單位，即p65和p50。NF-κB通常與IκB結(jié)合成無活性的形式存在于胞質(zhì)中，當受氧化劑、細菌、毒素、炎癥細胞因子的刺激后被激活，經(jīng)歷快速磷酸化后IκB被非特異性蛋白酶水解，從而使p65蛋白的核定位信號暴露，導(dǎo)致NF-κB快速向細胞核轉(zhuǎn)移，結(jié)合在被誘導(dǎo)基因啟動子序列上與之相同的κB位點，啟動基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成[39]。因此，p65蛋白的核轉(zhuǎn)移是NF-κB活化的重要前提與關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)，SG是NF-κB活化、IκBα磷酸化和降解的抑制劑[40]，同時p65、p50等亞基蛋白的核轉(zhuǎn)移有利于NF-κB的激活與炎癥的發(fā)展[18]。本研究顯示，與對照組相比，LPS組細胞總蛋白中IκBα蛋白表達量極顯著降低，可能是因為IκBα發(fā)生了磷酸化，細胞核蛋白中p65蛋白表達量顯著增加和胞漿中p65蛋白表達量極顯著減少，提示LPS使NF-κB激活從而促進p65的核轉(zhuǎn)移；與LPS組相比，SG+LPS組細胞核蛋白中p65蛋白表達量極顯著下降，細胞胞漿蛋白中p65和細胞總蛋白中IκBα蛋白表達量極顯著升高，說明SG抑制了p65核轉(zhuǎn)移，降低IκBα磷酸化，進而抑制LPS致炎IPEC-J2細胞的NF-κB信號通路活化來降低炎癥的表達。

4 結(jié) 論

SG可通過下調(diào)NF-κB信號通路中NF-κB1A、IKKε、NF-κB1、NF-κB2、TNFAIP3、IL-6、IL-8的表達，減少IL-6、IL-8的分泌，進而增強IPEC-J2細胞的抗炎能力；SG上調(diào)LPS致炎IPEC-J2細胞總蛋白中IκBα和胞漿蛋白中p65的蛋白表達，降低細胞核蛋白中p65的蛋白表達，抑制了p65向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進而抑制NF-κB信號通路活化，減輕IPEC-J2細胞的炎癥反應(yīng)。