11S球蛋白通過核因子-κB、誘導型一氧化氮合酶、c-Jun N端激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路誘導豬小腸上皮細胞損傷的研究

王 蕾 孫智峰 彭成璐 丁紅研 王 志 李思婷 王承智 李 玉 王希春 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥230061)

大豆貯藏蛋白主要由球蛋白組成，球蛋白按沉淀系數(shù)分為2S、7S、11S和15S 4種主要類型。11S球蛋白是大豆球蛋白的主要成分之一，其質(zhì)量百分數(shù)占大豆籽實總蛋白的19.5%～23.1%和總球蛋白的40.0%，易引起幼齡動物免疫球蛋白E(IgE)型過敏反應[1]。11S球蛋白含有5個亞基，約20 ku的堿性多肽和約40 ku的酸性多肽(由二硫鍵相連)組成每個亞基的結(jié)構(gòu)。根據(jù)蛋白質(zhì)在動物腸道中的吸收規(guī)律，大豆球蛋白主要吸收部位在小腸，小部分見于胃和大腸中[2-3]。11S球蛋白經(jīng)幼齡動物采食進入腸道后，腸道出現(xiàn)明顯炎癥浸潤，誘導腸黏膜細胞凋亡，使小腸通透性升高，損壞腸黏膜屏障[4]。腸上皮對環(huán)境起著動態(tài)屏障的作用，整合了多種信號，包括來自代謝物、共生微生物區(qū)系、免疫反應和衰老應激源的信號。腸上皮細胞通過不斷地增殖更新來替換受損的細胞，以維持腸道上皮的正常屏障功能。

仔豬小腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)處于小腸第1層，保存了大部分細胞的原有上皮特性，在構(gòu)成完整的管腔環(huán)境過程中發(fā)揮重要作用。體外研究表明，11S球蛋白降低IPEC-J2細胞的跨膜電阻值，提高細胞通透性，抑制細胞增殖，誘導腸細胞損傷凋亡[5]。本課題組前期研究證實，11S球蛋白分別通過核因子-κB(NF-κB)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路引起IPEC-J2細胞損傷和凋亡[6-7]。p38 MAPK抑制劑SB202190與腺嘌呤核苷三磷酸競爭抑制p38 MAPK活性，降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量[8]。JNK抑制劑SP600125可以抑制JNKmRNA的表達[9]。二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)是NF-κB的一種強效抑制劑，它既能抵抗自由基的毒性作用，也能抑制促炎性細胞因子的生成[10]。Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)是一種非特異性的一氧化氮合酶(NOS)抑制劑，能同時抑制神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和iNOS的表達[11]。本試驗在前期研究的基礎上，構(gòu)建IPEC-J2細胞體外模型，測定NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK分別在各自抑制劑作用下，IPEC-J2細胞活性以及相關炎性因子含量和蛋白表達水平，并在透射電鏡下觀察IPEC-J2細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的完整性，分析11S球蛋白通過JNK、p38 MAPK、NF-κB和iNOS信號通路誘導IPEC-J2細胞損傷的差異，為11S球蛋白引起IPEC-J2細胞損傷的分子機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

11S球蛋白購自中國農(nóng)業(yè)大學食品工程學院，并進一步提純至91.8%。IPEC-J2細胞購自武漢市農(nóng)業(yè)科學院細胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基由美國Thermo公司提供，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Biosharp公司，β-肌動蛋白(β-actin)由愛必信(上海)生物科技有限公司提供，HPR辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗和山羊抗鼠二抗購自Biosharp公司，PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190購自碧云天生物技術(shù)公司。一氧化氮(NO)、TNF-α、干擾素-γ(INF-γ)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗分組與設計

將對數(shù)生長期中的IPEC-J2細胞，按照1×105個/mL的密度接種在6孔細胞板后，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，隨機分為6組：A組(對照組)無添加，B組添加5 mg/mL的11S球蛋白，C組添加5 mg/mL的11S球蛋白+1 μmol/L的PDTC，D組添加5 mg/mL的11S球蛋白+1 μmol/L的L-NAME，E組添加5 mg/mL的11S球蛋白+1 μmol/L的SP600125，F(xiàn)組添加5 mg/mL的11S球蛋白+1 μmol/L的SB202190，每組設置3個重復。

1.3 細胞活性測定

按照5 000個/孔的密度將對數(shù)生長期中的IPEC-J2細胞懸液(100 μL/孔)接種在96孔板中，細胞貼壁后，按照試驗設計分別添加11S球蛋白和抑制劑，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育至出現(xiàn)明顯的顏色反應。用酶標儀測定450 nm處的光密度(optical density，OD)值，檢測細胞活性。

1.4 NO、TNF-α、INF-γ和IL-10含量測定

按照試驗設計，將各組細胞培養(yǎng)24 h后，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。隨后在每組樣品中加入500 μL含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)，超聲裂解各組樣品(冰水中)。收集細胞裂解液，1 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，依據(jù)ELISA試劑盒說明進行試驗，檢測NO、TNF-α、INF-γ和IL-10含量。

1.5 蘇木精-伊紅(HE)染色

按照試驗分組與設計，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，制作切片。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，無水乙醇Ⅰ3 min，無水乙醇Ⅱ 3 min，乙醇Ⅰ(95%) 3 min，乙醇Ⅱ(95%) 3 min，乙醇(80%)3 min，蒸餾水1 min。切片放入蘇木素染液中染色細胞核1～3 min，切片放入伊紅染液中染色細胞質(zhì)1～3 min，流水清洗后脫水封片，顯微鏡鏡檢，分析圖像。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)

按照試驗設計，將各組細胞培養(yǎng)24 h后，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管加入1 mL的4%多聚甲醛4 ℃下固定12 h后，PBS洗滌3次(4 ℃、5 000 r/min、15 min)之后用2%鋨酸滲透酸固定4 h。PBS緩沖液沖洗后，用30%～100%酒精梯度脫水，滲透包埋，切割超薄切片染色，在JEM-1230透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)下拍攝圖片。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK mRNA相對表達量

表1 基因引物參數(shù)

1.8 Western blot檢測NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK蛋白表達水平

按照試驗設計，將各組細胞培養(yǎng)24 h后，收集細胞，將IPEC-J2細胞進行Western Blot印跡處理。每個十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(12%)泳道加入20 μg的總蛋白電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜4 ℃下與一抗孵育過夜后用TBST緩沖液清洗3次，進行二抗孵育。洗膜3次，放入凝膠成像系統(tǒng)顯影拍攝。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件的ANOVA程序進行方差分析，LSD法進行顯著性比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用Graph Pad Prism 7.0軟件繪制柱狀圖，使用Quantity One軟件分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 11S球蛋白、PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190對IPEC-J2細胞活性的影響

如圖1所示，與A組相比，B組細胞活性極顯著下降(P<0.01)。與B組相比，分別添加1 μmol/L的PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190后，C、D、E和F組細胞活性極顯著上升(P<0.01)。C組細胞活性顯著高于D、E和F組(P<0.05)。

不同組別之間，數(shù)據(jù)點標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 11S球蛋白、PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190對IPEC-J2細胞因子和NO含量的影響

如圖2所示，與A組相比，B組NO、TNF-α和INF-γ含量均極顯著升高(P<0.01)。與B組相比，C、D、E和F組NO、TNF-α和INF-γ含量均極顯著降低(P<0.01)。與A組相比，B組IL-10含量極顯著降低(P<0.01)。與B組相比，C、D、E和F組IL-10含量極顯著升高(P<0.01)。

2.3 IPEC-J2細胞的HE染色圖像

HE染色圖像如圖3所示，A組的細胞膜完整，核仁飽滿；B組的細胞腫脹或破裂，細胞外形結(jié)構(gòu)異形，核仁皺縮。與B組相比，C、D、E和F組的細胞損傷情況明顯減輕，細胞外形及細胞膜相對完整；與D、E和F組相比，C組的細胞形態(tài)及細胞膜更加規(guī)則完整，核仁皺縮現(xiàn)象明顯改善。

2.4 透射電鏡觀察結(jié)果

如圖4所示，A組的細胞外形結(jié)構(gòu)及細胞器形態(tài)完整，胞漿致密，核染色質(zhì)分布均勻；B組的細胞核周圍出現(xiàn)空泡，細胞漿減少，細胞核增大異形、邊界不整齊，核層退化，染色質(zhì)皺縮，細胞質(zhì)凝結(jié)。分別添加1 μmol/L的PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190后，C、D、E和F組的細胞結(jié)構(gòu)趨于完整且細胞質(zhì)空泡化減少；與D、E和F組相比，C組細胞膜形態(tài)更加規(guī)則完整，細胞漿增多，細胞核大小正常、形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布更加致密均勻。

2.5 PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190對NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK mRNA相對表達量的影響

如圖5所示，與A組相比，B組的NF-κB、iNOS、JNK和p38MAPKmRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)。與B組相比，分別添加1 μmol/L的PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190后，C和F組的NF-κB、iNOS、JNK和p38MAPKmRNA相對表達量顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)，D組的NF-κB、iNOS和JNKmRNA相對表達量極顯著下降(P<0.01)，E組的NF-κB、JNK和p38MAPKmRNA相對表達量顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)。

2.6 11S、PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190對NF-кB、iNOS、JNK和p38 MAPK蛋白表達水平的影響

如圖6所示，與A組相比，B組的NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK蛋白表達水平極顯著升高(P<0.01)。與B組相比，分別添加1 μmol/L的PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190后，C、E和F組的NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK蛋白表達水平極顯著下降(P<0.01)，D組的NF-κB、iNOS和JNK蛋白表達水平極顯著下降(P<0.01)。

3 討 論

Stokes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大豆抗原蛋白介導T淋巴細胞免疫應答產(chǎn)生過量細胞因子引起豬腸上皮結(jié)構(gòu)損傷。細胞因子IL-10主要由輔助性T細胞2(Th2)產(chǎn)生，在過敏性炎癥反應中發(fā)揮重要作用。敲除IL-10的小鼠結(jié)腸黏膜增厚，腸道炎性細胞浸潤明顯，炎癥相關基因表達量上升，自發(fā)形成慢性小腸炎癥[13]。劉欣[14]用11S球蛋白灌胃小鼠建立體內(nèi)試驗模型，qRT-PCR檢測小鼠小腸組織，發(fā)現(xiàn)IL-10 mRNA的相對表達量降低。本試驗中，添加5 mg/mL的11S球蛋白后，IL-10含量極顯著下降；添加1 μmol/L的PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190后，IL-10含量極顯著上升。這提示在11S球蛋白誘導的腸道過敏炎癥反應中，IL-10是重要的免疫調(diào)節(jié)劑。IL-10參與的免疫抑制反應是由p38 MAPK途徑介導的[15]，p38 MAPK、JNK和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路下游的3個信號級聯(lián)通路，MAPK信號通路調(diào)控腸道細胞的增殖和免疫反應，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[16]。Peng等[17]采用11S球蛋白飼喂斷奶仔豬構(gòu)建體內(nèi)試驗模型發(fā)現(xiàn)，11S球蛋白誘導腸道組織JNK和p38 MAPK蛋白過度表達。張瑜[18]通過體外培養(yǎng)IPEC-J2細胞發(fā)現(xiàn)，隨11S球蛋白濃度增加，IPEC-J2細胞磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)和磷酸化p38(p-p38)蛋白表達水平逐漸增加，細胞活性顯著下降，細胞損傷程度逐漸加重；添加SP600125和SB202190后，p-JNK和p-p38蛋白表達水平顯著下降，且能夠抑制細胞損傷。本試驗中，添加5 mg/mL的11S球蛋白后，IPEC-J2細胞活性極顯著下降，JNK和p38 MAPK蛋白表達水平及mRNA相對表達量極顯著升高；添加SP600125和SB202190后，細胞活性極顯著上升，JNK和p38 MAPK蛋白表達水平及mRNA相對表達量極顯著降低，說明11S球蛋白通過JNK和p38 MAPK信號通路介導IPEC-J2細胞損傷。

*表示與A組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與A組相比差異極顯著(P<0.01)。#表示與B組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與B組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖3 HE染色觀察IPEC-J2細胞的細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)

圖4 透射電鏡觀察IPEC-J2細胞的超微結(jié)構(gòu)

11S球蛋白誘導的仔豬過敏反應主要是Th2型免疫反應[1]，TNF-α和INF-γ是Th2型免疫反應的重要產(chǎn)物[19]。在卵蛋白致敏的小鼠模型中，TNF-α和INF-γ共同誘導細胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)，促進炎癥反應[20]。這與本試驗11S球蛋白處理IPEC-2細胞后，ELISA檢測顯示TNF-α和INF-γ含量極顯著上升結(jié)果一致。TNF-α和INF-γ共同誘導細胞NF-κB抑制蛋白α的磷酸化和降解，導致NF-κB/p65的磷酸化及其核轉(zhuǎn)位[21]，激活NF-κB信號通路。在細胞核中，NF-κB促進炎癥反應的基因表達，引起細胞凋亡[22]。體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，11S球蛋白激活NF-κB信號通路誘導IPEC-J2細胞凋亡，損傷斷奶仔豬腸道組織[17-18]。Yi等[23]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶導致的仔豬空腸炎癥與空腸IFN-γmRNA相對表達量升高與NF-κB信號通路激活有關。本試驗用5 mg/mL的11S球蛋白處理IPEC-J2細胞后，細胞活性極顯著下降，HE染色可見細胞膜破裂和細胞核皺縮，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)空泡化、染色質(zhì)邊集，NF-κB蛋白表達水平和mRNA相對表達量顯著提高；添加1 μmol/L的PDTC預處理IPEC-J2細胞后，細胞活性極顯著升高，NF-κB蛋白表達水平和mRNA相對表達量顯著下降，這表明11S球蛋白通過NF-κB信號通路介導IPEC-J2細胞損傷。

圖5 qRT-PCR檢測細胞中NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK mRNA相對表達量

大豆富含的L-精氨酸是NO的前體，NO在iNOS催化L-精氨酸的過程中產(chǎn)生，是一種細胞炎性介質(zhì)[24]。p38 MAPK通路增加細胞內(nèi)NO的產(chǎn)生[15]，NO除激活細胞死亡受體途徑和線粒體途徑誘導細胞凋亡外，還能調(diào)節(jié)其他炎癥因子(如TNF-α)的釋放進而加強炎癥反應[25]。本試驗中，添加5 mg/mL的11S球蛋白處理IPEC-J2細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞活性極顯著下降，NO和TNF-α含量極顯著升高，iNOS蛋白表達水平和mRNA相對表達量顯著或極顯著升高；添加L-NAME后，NO和TNF-α含量極顯著降低，細胞活性極顯著上升，iNOS蛋白表達水平和mRNA相對表達量顯著降低，表明L-NAME能夠通過調(diào)節(jié)iNOS的表達減少炎癥介質(zhì)，抑制細胞損傷。Kaji等[26]研究發(fā)現(xiàn)，腸道平滑肌細胞和巨噬細胞中過量表達的iNOS引起細胞損傷，L-NAME預處理可以阻止細胞損傷。Leit?o等[27]在甲氨蝶呤(MTX)誘導的腸黏膜炎癥中發(fā)現(xiàn)iNOSmRNA相對表達量顯著增加，添加L-NAME后可減輕小腸絨毛和隱窩損傷、細胞凋亡現(xiàn)象。

細胞信號轉(zhuǎn)導是多通路、多環(huán)節(jié)、多層次高度復雜的可控反應，信號的啟動、放大和終止是相互作用的正負反饋機制。1種或幾種信號通路的異常表達，即可能造成整個信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的失調(diào)，進而引發(fā)病變。MAPK和NF-κB信號通路的異常激活促進炎癥反應，是導致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的重要原因[28]。研究表明，IBD患者腸組織中的JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表達水平顯著上升[29-30]。Berghe等[31]研究表明，p38 MAPK通路的激活有助于NF-κB調(diào)節(jié)其p65亞基的反式激活能力。NF-κB是典型的促炎性信號通路，炎性細胞因子激活NF-κB通路[21]，持續(xù)激活的NF-κB編碼促炎細胞因子及iNOS[32]，形成炎癥反應的正反饋回路。Rogler等[33]在潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患者的黏膜活檢標本中，發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白表達水平與腸上皮細胞的活性和炎癥的嚴重程度顯著相關。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，SP600125、SB202190和PDTC均能顯著緩解腸道炎癥[34-36]，這與本試驗添加抑制劑后能夠顯著抑制IPEC-J2細胞損傷的結(jié)果相符。本試驗中，與分別添加1 μmol/L的L-NAME、SP600125和SB202190組相比，添加1 μmol/L PDTC組的細胞活性顯著高于上述3組，HE染色可見細胞折光性強、胞質(zhì)飽滿、核質(zhì)清晰，透射電鏡觀察細胞形態(tài)與對照組細胞形態(tài)相近，細胞核結(jié)構(gòu)完整、核染色質(zhì)分布更均勻且胞質(zhì)空泡化明顯減少。這說明PDTC能夠抑制11S球蛋白介導的IPEC-J2細胞損傷，且抑制細胞損傷效果優(yōu)于L-NAME、SP600125和SB202190。這表明NF-κB信號通路在11S球蛋白通過JNK/p38 MAPK/NF-κB/iNOS信號通路介導IPEC-J2細胞損傷的過程中發(fā)揮關鍵作用，這可能與持續(xù)上調(diào)的NF-κB信號通路激活其他促炎途徑，使炎癥反應級聯(lián)放大有關。

圖6 Western blot檢測細胞中NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK蛋白表達水平

4 結(jié) 論

①11S球蛋白通過JNK/p38 MAPK/NF-κB/iNOS信號通路誘導IPEC-J2細胞損傷，促進NO、TNF-α和INF-γ分泌，抑制IL-10分泌，提高NF-κB、iNOS、JNK和p38MAPKmRNA相對表達量，增加NF-κB、iNOS、JNK和p38 MAPK蛋白表達水平，添加PDTC、L-NAME、SP600125和SB202190后，均能抑制IPEC-J2細胞損傷。

②添加PDTC組的IPEC-J2細胞的活性、細胞形狀和細胞器結(jié)構(gòu)的完整性均優(yōu)于添加L-NAME、SP600125和SB202190組。NF-κB信號通路在11S球蛋白通過JNK/p38 MAPK/NF-κB/iNOS信號通路介導IPEC-J2細胞損傷的過程中發(fā)揮關鍵作用。