外源添加山梨醇和海藻糖對意大利蜜蜂抗寒性能的影響

趙麗娜 張衛(wèi)星 秦 明 王 穎 王紅芳 劉振國 胥保華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271018)

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗于2019年3月底至2019年10月底在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗蜂場和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)本部2號樓進(jìn)行。從意蜂姊妹蜂群中隨機(jī)選取900只剛出房的幼蜂，隨機(jī)分成6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)50只蜜蜂。6組均于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，于常溫(30 ℃)和冷處理(4 ℃冷馴化2 h)條件下，分別飼喂蔗糖溶液(對照，由蔗糖和去離子水配制成的蔗糖水平為50%的糖溶液)、海藻糖溶液(由蔗糖、去離子水和海藻糖配制成的海藻糖水平為5%的糖溶液)及山梨醇溶液(由蔗糖、去離子水和山梨醇配制成的山梨醇水平為10%的糖溶液)。

各組蜜蜂飼養(yǎng)于飼喂盒中(每盒50只蜜蜂)，并將飼喂盒放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)恒溫恒濕培養(yǎng)箱的溫度為30 ℃，相對濕度為50%～60%，各組分別飼喂12 d，冷處理條件下的3個組在飼喂12 d后放置于4 ℃低溫培養(yǎng)箱中冷馴化2 h。蜜蜂冷凍于-80 ℃冰箱中儲存。另取900只意蜂，按照以上分組飼養(yǎng)，用于取血淋巴。蜜蜂抗寒性能指標(biāo)包括游離水、結(jié)合水、脂肪、糖原和蛋白質(zhì)含量，THL、SDH活性以及血淋巴中山梨醇、海藻糖、果糖含量。并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測蜂體海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、SDH的mRNA相對表達(dá)量差異。

1.2 蜂體過冷卻點、冰點測定

過冷卻點、冰點的測定參考秦玉川等[18]的熱電偶方法，使用低溫恒溫槽和數(shù)據(jù)采集器等組成的過冷卻點測定系統(tǒng)，將溫度探頭置于蜜蜂腹部，并進(jìn)行固定。溫度探頭與計算機(jī)系統(tǒng)相連置于低溫恒溫槽中，蜂體溫度隨著恒溫箱溫度以2 ℃/min持續(xù)下降，直至蜂體開始結(jié)冰，蜂體在小分子抗凍保護(hù)劑的作用下釋放潛熱，體溫開始回升，體內(nèi)剛開始回升時的溫度為過冷卻點。蜂體溫度上升到最高點后開始下降，蜜蜂開始結(jié)冰，此轉(zhuǎn)折點記錄的溫度即冰點。每個組各取48只意蜂(每個重復(fù)16只)分別進(jìn)行測定。

1.3 蜂體游離水含量測定

每個重復(fù)取意蜂10只，放入已知重量的稱量瓶中，用電子天平(精度0.01 mg)稱量鮮重(FW)，然后將蜜蜂樣本放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中65 ℃、48 h，測定干重(DW)，計算蜂體的游離水含量。

游離水含量(%)=[(FW-DW)/FW]×100。

1.4 蜂體脂肪含量測定

測完含水量的蜂體采用氯仿甲醇法測定脂肪含量:將氯仿和甲醇按體積比2∶1配制20 mL氯仿-甲醇(2∶1)溶液待用。取上述配好的溶液2 mL，與測完含水量的蜂體充分勻漿，再離心10 min(5 000 r/min)，取上清，殘余固體用2 mL氯仿-甲醇(2∶1)溶液離心10 min(5 000 r/min)，取上清，上清中加入1.2 mL 1.6% CaCl2，蓋緊搖晃后靜置1 h，離心10 min(5 000 r/min)，棄上清。用2% CaCl2-氯仿-甲醇(3∶8∶4)混合液的下層液1 mL加入上清中，離心10 min，使用移液槍將上述溶液離心10 min后的上清液吸取，并取1 mL 2% CaCl2-氯仿-甲醇(3∶8∶4)混合液的上層液輕輕置于離心管下層液。離心10 min，繼續(xù)使用移液槍吸取上清液后，將剩下的下層液全部導(dǎo)入稱量瓶中，在70 ℃干燥24 h，稱重即為脂肪含量。

1.5 蜂體糖原含量測定

每個重復(fù)取3只。準(zhǔn)確稱取蜂體0.1～0.2 g樣品，加入0.75 mL提取液充分勻漿；轉(zhuǎn)移至10 mL試管中；將試管放入恒溫水浴鍋中95 ℃水浴20 min(蓋緊，防止水分散失)，隔5 min振搖試管1次，使充分混勻；待組織全部溶解后，將試管冷卻至室溫，用蒸餾水定容到5 mL，振蕩混勻，8 000 r/min、25 ℃離心10 min，取上清液測定糖原含量。

1.6 血淋巴中小分子糖醇含量測定

每個重復(fù)取50只蜜蜂，用毛細(xì)管取意蜂血淋巴100 μL于離心管中，采用試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測定血淋巴中海藻糖、山梨醇、果糖含量，采用日立7020型全自動生化分析儀測定血淋巴中葡萄糖含量。

1.7 蜂體THL活性測定

每個重復(fù)取3只蜜蜂，采用THL試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測定:按照蜂體組織質(zhì)量(g)∶提取液體積(mL)為1∶10比例，冰浴中充分勻漿。勻漿液于4 ℃低溫離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min，取上清用EL80S超級酶標(biāo)儀在505 nm處測定吸光度。余下蜂體上清，用EL80S超級酶標(biāo)儀在562 nm處測定吸光度，計算蛋白質(zhì)濃度。

肉仔鼻子里哼出一聲。大概覺得身板只有他一半的牛皮糖再厲害也不能把他怎么樣。于是沒把這事放心上，照常賣他的肉去了。

1.8 蜂體SDH活性測定

每個重復(fù)取3只蜜蜂，采用SDH試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測定。按照蜂體組織質(zhì)量(g)∶提取液體積(mL)為1∶10的比例，進(jìn)行冰浴勻漿。4 ℃低溫離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min，取上清，用紫外分光光度計在340 nm處測定吸光度，計算酶活性。剩余上清液用于測定相應(yīng)蜂體的蛋白質(zhì)濃度。

1.9 總RNA提取與qRT-PCR

采用qRT-PCR法檢測TPS、SDHmRNA相對表達(dá)量。每個重復(fù)選取5只蜜蜂液氮研磨，Trizol法提取總mRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa：DRR037A)將總RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄操作步驟如下: 20 μL體系混勻后，25 ℃反應(yīng)10 min，55 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃滅活5 min，4 ℃終止反應(yīng)，共1個循環(huán)，調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度于相同水平后，-20 ℃保存待用。取1 000 ng cDNA加入到20 μL熒光定量體系中，按照熒光定量試劑盒(TaKaRa)操作指南，用7500 Real-Time PCR儀(ABI 7500，美國)檢測目的基因相對表達(dá)量。目的基因引物設(shè)計參考序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫，以β-肌動蛋白(β-action)為內(nèi)參，采用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計，委托生工生物科技有限公司合成引物，引物序列見表1。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用Duncan氏法，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 意蜂過冷卻點及冰點

由圖1可知，對照組、海藻糖組和山梨醇組意蜂的過冷卻點分別為(-5.38±0.15) ℃、(-5.79±0.13) ℃、(-6.03±0.10) ℃。與對照組相比，山梨醇組和海藻糖組意蜂的過冷卻點顯著降低(P<0.05)。對照組、海藻糖組和山梨醇組意蜂的冰點分別為(-2.88±0.21) ℃、(-3.41±0.15) ℃、(-3.55±0.15) ℃。與對照組相比，山梨醇組和海藻糖組意蜂的冰點顯著降低(P<0.05)。

表1 試驗中PCR引物

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 意蜂蜂體游離水含量

由圖2可知，常溫條件下，對照組、海藻糖組、山梨醇組蜂體游離水含量分別為(76.33±0.88)%、(75.33±0.88)%、(74.00±1.15)%。冷處理條件下，對照組、海藻糖組、山梨醇組蜂體游離水含量分別為(72.67±0.88)%、(74.00±0.58)%、(73.00±0.58)%。結(jié)果顯示，經(jīng)冷處理后的對照組蜂體游離水含量顯著降低(P<0.05)。意蜂通過降低體內(nèi)的游離水含量來提高其抗寒性，添加外源山梨醇和海藻糖后，意蜂冷處理以及常溫條件下蜂體游離水含量無顯著差異(P>0.05)，這說明山梨醇和海藻糖并不是通過降低蜂體游離水含量來提高其抗寒性。

*表示常溫條件下的對照組與冷處理條件下的對照組間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 意蜂蜂體脂肪和糖原含量

由表2可知，對照組蜂體脂肪含量在冷處理后顯著增加(P<0.05)，常溫與冷處理條件下，與對照組相比，山梨醇組和海藻糖組蜂體脂肪含量變化不顯著(P>0.05)。對照組冷處理后蜂體糖原含量顯著提升(P<0.05)，并且糖漿中添加外源山梨醇、海藻糖后無論是常溫還是冷處理條件下，蜂體糖原含量都有顯著提升(P<0.05)。

表2 不同處理對意蜂蜂體脂肪和糖原含量的影響

2.4 意蜂血淋巴小分子糖醇含量

由表3可知，對照組血淋巴中山梨醇、海藻糖、葡萄糖、果糖含量在經(jīng)過低溫處理后顯著上升(P<0.05)。常溫條件下，山梨醇組血淋巴中山梨醇含量顯著提高(P<0.05)，冷處理條件下，血淋巴中山梨醇含量變化不顯著(P>0.05)。不管是常溫和冷處理條件下，海藻糖組血淋巴中海藻糖含量無顯著變化(P>0.05)。山梨醇組和海藻糖組在2種處理下血淋巴中葡萄糖含量顯著增加(P<0.05)。常溫條件下，山梨醇組血淋巴中果糖含量顯著增加(P<0.05)，海藻糖組血淋巴中果糖含量變化不顯著(P>0.05)，但是經(jīng)冷處理后顯著下降(P<0.05)。

表3 不同處理對意蜂血淋巴中小分子糖醇含量的影響

2.5 意蜂蜂體THL活性

由圖3可知，與對照組相比，無論是否經(jīng)過冷處理，糖漿中添加外源海藻糖后，蜂體THL的活性均顯著提高(P<0.05)。該結(jié)果表明糖漿中添加外源海藻糖后，蜂體THL活性提高，進(jìn)而促進(jìn)了蜂體內(nèi)海藻糖的分解。常溫和冷處理條件下，山梨醇組意蜂蜂體THL活性與其對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。

2.6 意蜂蜂體SDH活性

由圖4可知，常溫條件下，山梨醇組蜂體SDH活性顯著高于對照組(P<0.05)。冷處理條件下，山梨醇組蜂體SDH活性顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明，外源山梨醇的添加使蜂體SDH的活性提高，從而促進(jìn)了山梨醇的分解。在常溫和冷處理條件下，海藻糖組蜂體SDH活性與各自的對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。

常溫條件下，數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)；冷處理條件下，數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖4 不同處理對意蜂蜂體SDH活性的影響

2.7 意蜂TPS、SDH mRNA相對表達(dá)量

在常溫和冷處理條件下山梨醇組意蜂SDHmRNA相對表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，并且顯著高于各自對照組(P<0.05)(圖5)。常溫條件下，海藻糖組意蜂的TPSmRNA相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，海藻糖組經(jīng)冷處理后TPSmRNA相對表達(dá)量有下調(diào)的趨勢，但是與其對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

圖5 不同處理對意蜂SDH mRNA相對表達(dá)量的影響

圖6 不同處理對意蜂TPS mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

蜜蜂可以通過降低自身過冷卻點來增強(qiáng)自身的抗寒性。當(dāng)蜜蜂蜂體溫度低于過冷卻點時，體液開始結(jié)成冰晶，蜜蜂開始釋放熱量。通過對熱量的測定，可以靈敏探測出蜜蜂的過冷卻點，過冷卻點可以作為蜜蜂抗寒性的主要指標(biāo)之一。本研究通過測定外源添加山梨醇、海藻糖后意蜂過冷卻點的變化，結(jié)果顯示意蜂過冷卻點分別下降了0.65、0.41 ℃。試驗結(jié)果表明，外源添加山梨醇、海藻糖顯著降低了蜜蜂的過冷卻點，進(jìn)而提高了蜜蜂的抗寒性。本研究與羅立平等[19]研究外源添加海藻糖對花絨寄甲成蟲存活和抗寒性的影響結(jié)果一致：不管是否經(jīng)低溫處理，取食含9%海藻糖的半人工飼料的花絨寄甲成蟲與對照組成蟲相比，其過冷卻點顯著降低。

昆蟲在越冬過程中通過降低體內(nèi)游離水含量，使蟲體內(nèi)溶質(zhì)的濃度提高，進(jìn)而降低昆蟲過冷卻點，以此來提高其抗寒性。本試驗中，冷處理后意蜂的游離水含量顯著降低，與上述研究結(jié)果一致。無論低溫處理與否，試驗組與對照組相比蜂體含水量無顯著差異，這與羅立平等[19]對取食外源海藻糖的花絨寄甲的研究結(jié)果一致，推測可能是其體內(nèi)積累了足夠的海藻糖、山梨醇，無需通過排出水分增加溶質(zhì)濃度的方式來降低其過冷卻點。

脂肪在昆蟲抗寒性中發(fā)揮重要作用，是生物體進(jìn)行貯能和保溫的基礎(chǔ)物質(zhì)[20-22]。昆蟲體內(nèi)總脂肪的含量與其過冷卻點呈負(fù)相關(guān)，體內(nèi)脂肪含量越高，其過冷卻點越低[23-25]。本試驗結(jié)果表明，冷處理后意蜂的蜂體脂肪含量顯著提高，這與以上的研究結(jié)果一致，但是外源添加山梨醇、海藻糖后蜂體脂肪含量無顯著變化，這可能是因為添加山梨醇、海藻糖后所積累的能量已經(jīng)足夠抵御當(dāng)時低溫環(huán)境，不需要通過提高蜂體脂肪含量為蜜蜂提供能量。這與先前報道的鱗翅目等飛行昆蟲抗寒機(jī)制相符。例如飛蝗體內(nèi)血淋巴中海藻糖的含量下降到一定程度時，就會激活負(fù)責(zé)釋放儲存脂肪進(jìn)入血淋巴的促脂激素，以便釋放為飛行提供能量的脂類[26]。

TPS的作用是催化尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-G)生成海藻糖。在本試驗中，常溫條件下，海藻糖組意蜂TPSmRNA相對表達(dá)量顯著下調(diào)，這可能是因為外源添加海藻糖的增加使其體內(nèi)海藻糖的合成通路受到抑制。冷處理條件下，外源添加海藻糖后TPSmRNA相對表達(dá)量下調(diào)但不顯著，可能因為意蜂在冷應(yīng)激后需要大量積累海藻糖來提高其抗寒性，從而使TPSmRNA相對表達(dá)量下調(diào)不明顯。相關(guān)研究表明，在海藻糖的分解途徑中，滯育激素通過一系列反應(yīng)導(dǎo)致卵巢THL活性提高，使血液中的海藻糖分解成葡萄糖，葡萄糖進(jìn)入卵母細(xì)胞進(jìn)一步合成糖原誘導(dǎo)卵滯育，因此THL是滯育激素調(diào)控代謝過程中的關(guān)鍵酶，并且滯育激素是通過促進(jìn)THL的mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而提高酶活性，最終改變代謝途徑誘導(dǎo)卵滯育[27]。以上研究結(jié)果和本試驗中海藻糖的代謝反應(yīng)結(jié)果一致，外源添加海藻糖使蜂體THL的活性顯著提高，從而將蜂體內(nèi)的海藻糖分解成葡萄糖，引起葡萄糖含量的顯著增加。糖原是由多個葡萄糖組成的一種生物大分子，分子質(zhì)量約為107 ku，是動物體內(nèi)儲存葡萄糖的一種形式。血液中的葡萄糖含量通過糖原分解來維持，為機(jī)體新陳代謝提供能量[28]。本試驗結(jié)果顯示，外源添加海藻糖后蜂體糖原含量在常溫以及冷處理條件下都有顯著的上升。Crowe等[29]研究結(jié)果顯示，海藻糖能在THL的水解作用下轉(zhuǎn)化成葡萄糖，而葡萄糖在昆蟲體內(nèi)糖類代謝過程中可與糖原互相轉(zhuǎn)化，參與能量代謝。綜上所述，我們推測意蜂可能通過以下通路來提高機(jī)體抗寒性：UDP-G在TPS的作用下轉(zhuǎn)化成海藻糖，海藻糖在THL的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖，機(jī)體內(nèi)過多的葡萄糖以能量代謝途徑轉(zhuǎn)化為糖原，作為能量儲存在蜜蜂體內(nèi)，在環(huán)境脅迫下維持其機(jī)體正常的生命活動。

昆蟲在滯育期積累低分子質(zhì)量的多元醇和糖。山梨醇是滯育昆蟲最常見積累的多元醇之一，SDH是調(diào)節(jié)山梨醇代謝的關(guān)鍵酶，它催化山梨醇脫氫轉(zhuǎn)化為糖原。SDH在滯育期間表達(dá)水平存在明顯變化，在山梨醇利用和滯育解除中發(fā)揮著重要作用。Niimi等[30]查明了伴隨滯育卵的解除過程，SDH活性逐步提高，SDH是滯育解除過程中的一個關(guān)鍵酶。對SDH轉(zhuǎn)錄研究表明，滯育卵用5 ℃冷藏解除滯育后SDHmRNA相對表達(dá)量達(dá)到峰值，顯示出解除滯育的卵內(nèi)出現(xiàn)由山梨醇向糖原轉(zhuǎn)化[31]。本試驗結(jié)果表明，無論是常溫還是冷處理條件下，外源添加山梨醇均使意蜂蜂體糖原含量顯著提高、SDH的活性顯著提高、SDHmRNA相對表達(dá)量顯著上升，這與上述研究結(jié)果一致。在冷應(yīng)激期間變化明顯的糖類物質(zhì)還有互為同分異構(gòu)體的小分子糖——葡萄糖、果糖，它們均為活細(xì)胞的能量來源，研究表明，阿松扁葉蜂體內(nèi)葡萄糖、果糖含量在滯育初期較高，并且隨著越冬期環(huán)境溫度的變化葡萄糖含量持續(xù)上升，而果糖含量則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢變化[32]。在本試驗中，通過對蜂體血淋巴中葡萄糖含量的檢測結(jié)果得出，低溫處理后意蜂血淋巴中的葡萄糖含量相比于常溫飼養(yǎng)顯著升高。另外，山梨醇組的意蜂血淋巴中的葡萄糖和果糖含量同樣顯著升高。杜曉云[12]研究得出，柞蠶蛹在長時間的滯育過程中，脂肪體中的糖原逐漸在糖原磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘油，山梨醇在SDH的作用下轉(zhuǎn)化為果糖，果糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為糖原。此時幼蟲及蛹中有足夠的能量，使得昆蟲可以打破滯育，重新發(fā)育。綜合以上試驗結(jié)果推測，蜜蜂體內(nèi)的山梨醇通過以下代謝通路來提高抗寒性：山梨醇在SDH的作用下轉(zhuǎn)化成果糖，果糖再通過能量代謝轉(zhuǎn)化成葡萄糖，部分葡萄糖合成糖原作為儲能物質(zhì)儲存在體內(nèi)，或直接用于供能。這也充分說明意蜂體內(nèi)山梨醇、海藻糖等小分子物質(zhì)的積累和分解存在一定的平衡機(jī)制，在其面對外界低溫脅迫時共同發(fā)揮作用。

4 結(jié) 論

外源添加山梨醇和海藻糖組意蜂過冷卻點和冰點顯著低于對照組，二者通過增加意蜂血淋巴中小分子糖醇含量進(jìn)而提高機(jī)體抗寒性。TPS、LDH的表達(dá)特征證實了山梨醇和海藻糖在意蜂遭受低溫脅迫過程中具有重要作用。