添加乳酸菌對苜蓿青貯過程中總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性及主要黃酮苷元含量的影響

張嘉賓 李苗苗 靳思玉 王立超 周 昕 黃秋連 王 健 張愛忠 曹 陽

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶163319)

苜蓿(MedicagosativaL.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，營養(yǎng)豐富，常作為草食家畜重要的高蛋白質(zhì)粗飼料，同時(shí)還因生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高在諸多領(lǐng)域(醫(yī)學(xué)、美容、農(nóng)業(yè)等)備受青睞[1-2]。苜蓿中含有多種生物活性物質(zhì)，其中黃酮是苜蓿主要的活性成分，黃酮在植物體內(nèi)以糖苷和苷元2種形式存在，其中黃酮糖苷占總黃酮含量的97%左右，黃酮糖苷作為一類大分子物質(zhì)，不易滲入上皮細(xì)胞，難以被機(jī)體胃腸道直接吸收，其生物利用率相應(yīng)降低。通過一定技術(shù)手段將黃酮糖苷經(jīng)去糖基反應(yīng)轉(zhuǎn)化為功能活性更高且可被機(jī)體直接吸收的苷元形式從而提高其利用率。研究證明，黃酮苷元具有抗炎抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂肪代謝及雌激素樣等多種生理活性[3]。所以探索高黃酮提取率的苜蓿青貯技術(shù)，為家畜飼養(yǎng)提供功能性苜蓿青貯飼料、對家畜養(yǎng)殖中減少藥物使用、為人類提供安全健康的畜產(chǎn)品具有重要意義。在苜蓿青貯中乳酸菌的添加導(dǎo)致多種活性物含量顯著上升，包括多種游離氨基酸和多元醇[4]，乳酸菌發(fā)酵法可使黃酮類化合物結(jié)構(gòu)和組分發(fā)生改變，由糖苷轉(zhuǎn)變?yōu)檐赵问絒5]。多種動(dòng)物試驗(yàn)表明，黃酮苷元的吸收程度遠(yuǎn)高于糖苷形式，因此結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變能促進(jìn)其更好地發(fā)揮抗氧化和生物活性[6]。目前國內(nèi)在苜蓿黃酮糖苷脫糖基轉(zhuǎn)化成苷元方面的研究較少，主要集中于銀杏及大豆異黃酮生物轉(zhuǎn)化的研究。王洋等[7]報(bào)道，添加不同植物乳酸菌均能使苜蓿中黃酮提取率顯著提高，其中以植物乳酸桿菌的效果尤為明顯。黃酮生物轉(zhuǎn)化酶主要包括β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶[8]，目前研究最多的為β-葡萄糖苷酶，除優(yōu)越的生物轉(zhuǎn)化功能外，β-葡萄糖苷酶還是重要的增香酶，它能通過催化水解芳香基和烴基原子團(tuán)之間的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生葡萄糖和對應(yīng)配基，從而釋放芳香因子，常應(yīng)用于食品工業(yè)果酒增香等[9]。因此，本試驗(yàn)擬通過分析苜蓿青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)、總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性及主要黃酮苷元含量，研究添加乳酸菌對苜蓿青貯過程中總黃酮提取率的影響，分析苜蓿總黃酮提取率與發(fā)酵產(chǎn)物的關(guān)系，明確苜蓿青貯過程中總黃酮提取率的影響因素，探索減少苜蓿青貯中黃酮損失的青貯調(diào)制技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 苜蓿及添加劑制備

苜蓿于初花期刈割，顏色為綠色，莖葉分明，由黑龍江省蓬勃牧草有限公司提供，預(yù)干至含水量約50%并切碎至1～2 cm作為青貯原料，其常規(guī)化學(xué)成分見表1。試驗(yàn)選用的乳酸菌制劑為日本國立畜產(chǎn)研究所提供的植物乳桿菌Master-LP(Lactobacillusplantarum，日本雪印種苗株式會(huì)社生產(chǎn))，使用方法和劑量依據(jù)其包裝說明書，青貯原料中菌劑濃度為25 mg/kg，活菌數(shù)105CFU/g以上。

表1 青貯原料常規(guī)化學(xué)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用雙因素(添加×?xí)r間)完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將苜蓿原料分別進(jìn)行乳酸菌添加及無添加處理(對照)，添加乳酸菌是將菌粉與無菌水以1∶400比例混合制備成菌液，并以菌液形式按1∶100添加于青貯原料中，菌劑最終添加量為0.002 5%，活菌數(shù)為105CFU/mL。稱取200 g以上處理的樣品裝入聚乙烯袋(16 cm×25 cm)，使用真空包裝機(jī)(AT-620;Jodpack Co.,Ltd.,北京)真空密封，每個(gè)處理50個(gè)重復(fù)，置于避光處貯藏，貯藏溫度為(24±2) ℃，經(jīng)過0、1、3、5、7、15、22、39、46、53、60、67、74 d發(fā)酵后，各處理分別開封3袋，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 化學(xué)成分及發(fā)酵品質(zhì)

根據(jù)AOAC[10](1990)中的方法，通過電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-920B,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)測定干物質(zhì)(DM)含量；茂福爐(SX2-4-10,天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)測定有機(jī)物(OM)含量；利用凱氏定氮儀(K1100F,濟(jì)南海能儀器股份有限公司)測定粗蛋白質(zhì)(CP)、總氮含量；利用索氏提取器測定粗脂肪(EE)含量。中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量通過纖維分析儀(ANKOM A200i,美國安康)依據(jù)Van Soest等[11]的方法進(jìn)行分析。根據(jù)馮宗慈等[12]的分光光度計(jì)法，利用紫外可見分光光度計(jì)(UV-6100A,上海元析儀器有限公司)測定氨態(tài)氮的含量。

取20 g苜蓿青貯樣品裝入聚乙烯袋中，并加180 mL滅菌蒸餾水，利用均質(zhì)器(BagMixer-400VW;Interscience,法國)拍打90 s使袋中樣品充分混合制成青貯浸提液。采用便攜式pH計(jì)(FG-2;Mettler Toledo,上海)測定青貯浸提液pH。取袋中部分混合液用4層紗布過濾，所獲得濾液經(jīng)高速低溫離心機(jī)(6 500×g,4 ℃)離心5 min，再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，利用高效液相色譜儀(HPLC;JascoCorp,日本)分析測定乳酸、乙酸、丙酸及丁酸的含量。

1.4 總黃酮提取率

參照劉香萍等[13]的方法，采用超聲波輔助法提取苜蓿青貯樣品所含黃酮類化合物。以縱坐標(biāo)為吸光度(A)，橫坐標(biāo)為蘆丁質(zhì)量濃度(C，mg/g)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=12.06X+0.011(R2=0.999 9)。取2 mL提取液測定510 nm處吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算苜?？傸S酮提取率：

總黃酮提取率(mg/g)=(C×N×V)/m。

式中：C為曲線質(zhì)量濃度(mg/mL)；N為提取液稀釋倍數(shù)；V為最初提取液定容體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.5 β-葡萄糖苷酶活性

參考Funamoto等[14]和Kaewsuksaeng等[15]的方法制得酶粗提液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)對酶粗提液進(jìn)行β-葡萄糖苷酶活性的測定。

1.6 槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量

根據(jù)黃寧[16]的方法分析槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量。本試驗(yàn)采用高效液相色譜儀對苜蓿青貯中3種黃酮苷元含量進(jìn)行定量分析。試驗(yàn)參照黨亞鋒等[17]方法，色譜條件：c18硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫25 ℃；流動(dòng)相，乙腈：0.25%磷酸水溶液(50∶50)；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量10 μL;單次分析時(shí)間10 min。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010整理，根據(jù)雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)模型，使用SAS 9.0的GLM程序分析數(shù)據(jù)：

Yijl=μ+αi+βj+(α×β)ij+eijl。

式中：Yijl代表青貯發(fā)酵品質(zhì)；μ為總體平均值；αi為添加處理i(i=1，2)的效應(yīng)；βj為發(fā)酵時(shí)間處理j(j=0，1，3，5，7，15，22，39，46，53，60，67，74)的效應(yīng)；(α×β)ij為添加處理與發(fā)酵時(shí)間處理的互作效應(yīng)；eijl為試驗(yàn)誤差。采用Tukey法鑒定比較均值差異顯著性(P<0.05)。

采用SPSS Statistics 21軟件對有機(jī)酸含量、總黃酮提取率進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平；采用中線性回歸分析程序逐步回歸分析，在P<0.05水平下，建立回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1 添加乳酸菌對苜蓿青貯常規(guī)化學(xué)成分的影響

由表2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，粗脂肪含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。添加乳酸菌組干物質(zhì)含量在發(fā)酵第0、1、3、15、22、39、60、74天顯著高于對照組(P<0.05)，有機(jī)物含量在第3、5、39、46、74天顯著高于對照組(P<0.05)，粗蛋白質(zhì)含量在第22、46、53、60、67、74天顯著高于對照組(P<0.05)，粗脂肪含量在第1、3、5、7、15、22、46、53天顯著高于對照組(P<0.05)，添加及時(shí)間處理在各指標(biāo)上均表現(xiàn)出顯著的交互作用(P<0.05)。

表2 添加乳酸菌對苜蓿青貯常規(guī)化學(xué)成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表2項(xiàng)目 Items干物質(zhì)DM有機(jī)物OM粗蛋白質(zhì)CP粗脂肪EE酸性洗滌纖維ADF中性洗滌纖維NDF無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第15天Day 1542.84±0.25b88.93±0.1625.94±0.066.43±0.00b27.13±0.7941.78±2.0445.23±0.28a89.29±0.1925.94±0.066.55±0.01a26.59±1.0140.89±1.34無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第22天Day 2241.01±0.44b88.99±0.1426.20a±0.036.76±0.01b27.25±0.9744.19±0.53a45.73±0.32a89.29±0.1426.00b±0.386.91±0.10a26.66±1.4040.11±0.93b無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第39天Day 3940.72±2.04b88.99±0.04b26.07±0.056.82±0.0326.99±1.5540.09±0.7645.21±0.90a89.30±0.09a26.45±0.087.19±0.0226.32±1.2740.25±1.52無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第46天Day 4642.16±1.3388.87±0.04b25.37±0.06b6.79±0.01b26.45±0.6138.72±1.8043.98±0.5189.18±0.09a25.58±0.01a6.99±0.02a26.20±1.9638.78±1.15無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第53天Day 5341.86±1.3188.82±0.2626.32±0.05b7.14±0.01b26.33±2.4040.07±1.6144.03±1.0489.17±0.3226.50±0.03a7.30±0.01a25.98±1.2539.84±0.83無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第60天Day 6041.10±1.39b88.84±0.1125.85±0.06b7.10±0.3326.20±2.9739.30±3.9445.38±0.33a89.01±0.1026.03±0.05a7.17±0.1225.60±0.7339.19±2.63無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第67天Day 6741.89±2.4588.82±0.2125.03±0.02a6.92±1.0826.07±3.0937.94±2.5744.85±0.3688.98±0.2924.83±0.08b7.13±0.2525.30±2.2537.14±1.47無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第74天Day 7440.73±0.98b88.85±0.04b24.69±0.03b6.98±0.1325.70±2.4237.28±2.4844.89±0.38a88.90±0.05a24.85±0.03a7.30±0.1625.06±1.7437.12±2.14SEM0.778 0.3110.0910.1521.1351.361時(shí)間 Time<0.0050.0070.1060.0050.2170.267添加 Addition0.016 <0.005 <0.005 <0.005 0.001<0.005添加×?xí)r間 Addition×time<0.005<0.005<0.005<0.0050.002<0.005

2.2 添加乳酸菌對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知，苜蓿青貯pH隨著苜蓿青貯發(fā)酵時(shí)間延長顯著降低(P<0.05)，乳酸、乙酸含量及氨態(tài)氮/總氮均顯著上升(P<0.05)；添加乳酸菌組pH在第15、39、60、74天顯著低于對照組(P<0.05)，除第0、3、5天外，其他發(fā)酵天數(shù)乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05)；除第0、3、74天外，其他發(fā)酵天數(shù)乙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)；第3、5、7、15、22、39、53天丙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，第3、7、15、46、53、60天氨態(tài)氮/總氮顯著低于對照組(P<0.05)；所有樣品中均未檢出丙酸和丁酸。添加及時(shí)間處理在各指標(biāo)上均表現(xiàn)出顯著交互作用(P<0.05)。

2.3 添加乳酸菌對苜蓿青貯總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性、3種黃酮苷元含量的影響

由表4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性呈先升高后降低的趨勢，槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均顯著上升(P<0.05)；在整個(gè)發(fā)酵過程中，添加乳酸菌組的總黃酮提取率顯著高于對照組(P<0.05)，β-葡萄糖苷酶活性在第3、5、53天顯著高于對照組(P<0.05)，槲皮素含量在整個(gè)發(fā)酵過程均顯著高于對照組(P<0.05)，山奈酚含量除第1、15、22、46、67天外，其他天數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，異鼠李素含量除第0、1、5、15天外，其他天數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)；添加及時(shí)間處理在各指標(biāo)上均表現(xiàn)出顯著交互作用(P<0.05)。

表3 添加乳酸菌對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.4 總黃酮提取率與發(fā)酵產(chǎn)物的關(guān)系

由表5可知，總黃酮提取率與pH存在極顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，與乳酸含量存在極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，與乙酸含量存在顯著正相關(guān)性(P<0.05)。

2.5 總黃酮提取率、主要苷元的回歸分析

選用處理(X1，對照組=0，LAB組=1)和天數(shù)(X2)為自變量，以總黃酮提取率(mg/g)為因變量(Y)，建立回歸方程：Y=4.958+0.692X1+0.022X2，其中，樣本量n=3，相關(guān)系數(shù)R=0.733，添加和時(shí)間處理均對總黃酮提取率有極顯著影響(P<0.01)。

選用處理(X1，對照組=0，LAB組=1)和天數(shù)(X2)為自變量，以槲皮素含量(μg/mL)為因變量(Y)，建立回歸方程為：Y=15.925X1+0.244X2-7.365，其中，樣本量n=3，相關(guān)系數(shù)R=0.840，添加和時(shí)間處理均對槲皮素含量有極顯著影響(P<0.01)。

選用處理(X1，對照組=0，LAB組=1)和天數(shù)(X2)為自變量，以異鼠李素含量(μg/mL)為因變量(Y)，建立回歸方程為：Y=1.669X1+0.174X2+1.564，其中，樣本量n=3，相關(guān)系數(shù)R=0.982，添加和時(shí)間處理均對異鼠李素含量有極顯著影響(P<0.01)。

選用處理(X1，對照組=0，LAB處理組=1)，天數(shù)(X2)為自變量，以山奈酚含量(μg/mL)為因變量(Y)，建立回歸方程為：Y=55.338X1+3.489X2+157.752，其中，樣本量n=3，相關(guān)系數(shù)R=0.842，添加和時(shí)間處理均對異鼠李素含量有極顯著影響(P<0.01)。

表4 添加乳酸菌對苜蓿青貯總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性、主要苷元含量的影響

表5 總黃酮提取率與pH及有機(jī)酸含量的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 添加乳酸菌對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

氨態(tài)氮含量反映了青貯飼料蛋白質(zhì)降解程度，被廣泛應(yīng)用于衡量青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的好壞，其比值越大，說明被分解的氨基酸和蛋白質(zhì)越多，青貯效果越差[18]。本研究中，添加乳酸菌組青貯的pH、氨態(tài)氮/總氮顯著降低，乳酸、乙酸、丙酸含量顯著增加；隨著發(fā)酵時(shí)間延長，pH逐漸顯著降低，氨態(tài)氮/總氮及乳酸、乙酸、丙酸含量均逐漸顯著增加。王木川等[19]通過比較多種添加劑對苜蓿青貯品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌添加降低了苜蓿青貯的pH、氨態(tài)氮/總氮，提高了乳酸、乙酸含量，同時(shí)添加乳酸菌組未檢出丁酸。王麗學(xué)等[20]比較植物乳桿菌、片球菌和芽孢桿菌對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)成分的影響，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能顯著降低pH，顯著提高乳酸含量。

3.2 添加乳酸菌對苜蓿青貯總黃酮提取率的影響

類黃酮是苜蓿含有的主要活性生物成分之一，其含量受光照、溫度、土壤及空氣條件、生物因素的影響，苜蓿青貯中黃酮含量受發(fā)酵過程及添加劑的影響[21]。本研究中，乳酸菌的添加顯著提高了苜蓿青貯總黃酮提取率，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢。pH與總黃酮提取率存在極顯著負(fù)相關(guān)性，隨著乳酸菌的添加和發(fā)酵天數(shù)的延長pH下降，總黃酮提取率也逐漸上升；乳酸、乙酸的逐漸產(chǎn)生也會(huì)造成pH的下降，所以乳酸、乙酸含量對總黃酮提取率存在顯著正相關(guān)性。王洋等[7]分別以植物乳桿菌、干酪乳桿菌及戊糖片球菌為添加劑制作苜蓿青貯，分別在30、60 d測定總黃酮提取率，結(jié)果表明3種乳酸菌的添加均能顯著提高苜?？傸S酮提取率，其中植物乳桿菌添加效果最明顯，同時(shí)各添加組60 d黃酮提取率均高于或等于30 d。姜義寶等[22]在苜蓿青貯中添加植物乳桿菌，分別在3、5、7、15、30、60 d測定總黃酮提取率，研究發(fā)現(xiàn)隨著苜蓿青貯發(fā)酵時(shí)間延長總黃酮提取率逐漸增加，除3 d外其余發(fā)酵天數(shù)植物乳桿菌添加組黃酮提取率均高于對照組。

3.3 添加乳酸菌對苜蓿青貯β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶是重要的纖維素水解酶，能水解類黃酮糖苷鍵將化合態(tài)黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為可被動(dòng)物吸收利用的游離態(tài)黃酮苷元，常應(yīng)用于類黃酮的生物轉(zhuǎn)化。本研究中，乳酸菌的添加能顯著提高β-葡萄糖苷酶活性，同時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。曾子毅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，5株植物乳桿菌均具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶特性，其酶活性為4.630～14.168 U/g。Donkor等[24]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌、乳酸雙歧桿菌及干酪乳桿菌發(fā)酵大豆均能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶。因此，β-葡萄糖苷酶的活性在一定程度上與乳桿菌數(shù)量成正比，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.4 添加乳酸菌對苜蓿青貯3種黃酮苷元含量的影響

黃酮類化合物的主要活性形式苷元僅占總黃酮含量的3%左右，因此將黃酮由結(jié)合態(tài)糖苷轉(zhuǎn)化為游離態(tài)苷元的技術(shù)手段尤為重要[25]。本研究中，添加乳酸菌顯著提高了槲皮素、山奈酚、異鼠李素3種黃酮苷元含量。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量呈逐漸上升趨勢。賴婷等[26]分別以7種不同乳酸菌為添加劑對桂圓肉進(jìn)行發(fā)酵，并檢測發(fā)酵前后結(jié)合態(tài)與游離態(tài)黃酮含量比值，發(fā)現(xiàn)7種乳酸菌均能不同程度增加結(jié)合態(tài)與游離態(tài)黃酮含量比值，其中植物乳桿菌轉(zhuǎn)換能力最強(qiáng)。Wei等[27]采用5株不同乳酸菌對豆乳進(jìn)行發(fā)酵并檢測發(fā)酵前后游離態(tài)黃酮苷元含量，發(fā)現(xiàn)結(jié)合態(tài)至游離態(tài)轉(zhuǎn)化率高達(dá)62%～96%。李俶等[28]利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌對南酸棗進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后南酸棗中游離黃酮含量提高1.1倍。

4 結(jié) 論

綜上所述，添加乳酸菌可以顯著提高苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)，發(fā)酵品質(zhì)良好的苜蓿青貯可以提高總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性以及槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量。