高粱單寧提取物與聚乙二醇對體外瘤胃發(fā)酵參數及營養(yǎng)物質消化率的影響

肖敏敏 解 彪 楊 瀟 楊 玲 溫賢將 程冰冰 毛昌發(fā) 趙廣永*

(1.中國農業(yè)大學動物科技學院，北京100193；2.山西省農業(yè)科學院高粱研究所，晉中030600)

高粱是全世界五大重要谷物之一。高粱耐鹽堿、耐干旱，對土壤、氣候等具有較強的適應性。高粱營養(yǎng)豐富，其主要營養(yǎng)成分與玉米相近。因此，高粱作為動物的飼料原料具有重要的應用價值。高粱籽實含有抗營養(yǎng)因子——縮合單寧。Pan等[1]測定了28個不同品種高粱籽實的單寧含量，發(fā)現大部分品種的高粱單寧含量為0.67%～1.51%?？s合單寧極性很強，能夠與飼糧中的蛋白質結合，形成不易被瘤胃微生物降解的蛋白質-單寧復合物[2-3]。因此，單寧對飼糧中蛋白質具有過瘤胃保護作用。但是，很多研究顯示，飼糧中添加單寧會導致蛋白質的消化率下降。Yang等[4]的研究結果顯示，向肉牛飼糧中添加單寧酸降低了飼糧氮的消化率。Kronberg等[5]報道，飼糧中添加富含縮合單寧的胡枝子顆粒料，導致綿羊飼糧干物質和氮的消化率下降。Koenig等[6]報道，向肉牛飼糧中添加黑荊樹(Acaciamearnsii)單寧提取物降低了飼糧氮的消化率。上述結果表明，在瘤胃中形成的蛋白質-單寧復合物可能在反芻動物后部消化道中分解不完全，因而導致飼糧氮消化率的下降。

聚乙二醇(PEG)是無毒、無味、化學性質穩(wěn)定的乙二醇高聚物，在醫(yī)藥、食品、化工等眾多研究領域已被廣泛應用。PEG中的氫鍵能夠與單寧中的酚羥基結合形成穩(wěn)定的PEG-單寧復合物[7]。因此，單寧既能夠與蛋白質結合，也能夠與PEG結合，形成相應的復合物。也就是說，蛋白質和PEG之間在與單寧結合方面存在競爭作用。在飼糧中存在高粱單寧的條件下，添加PEG能否緩解高粱單寧對瘤胃發(fā)酵的不利影響，提高營養(yǎng)物質消化率，以及PEG在真胃中能否促進單寧-蛋白質復合物解離，釋放出蛋白質，提高蛋白質消化率，尚不清楚。本研究計劃采用體外兩步消化法研究高粱單寧提取物(STE)與PEG協同作用對體外瘤胃發(fā)酵參數和營養(yǎng)物質消化率的影響，闡明STE對瘤胃發(fā)酵參數的影響以及PEG能否緩解STE對營養(yǎng)物質消化造成的不利影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以精粗比為40∶60(干物質基礎)混合料作為體外發(fā)酵基質，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

STE由山西省農業(yè)科學院高粱研究所提供，參照國家標準GB/T 27985—2011測得單寧含量為61%(干物質基礎)。PEG(相對分子質量為4 000，分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

以3頭體重約為500 kg并裝有永久性瘤胃瘺管的安格斯閹公牛作為瘤胃液供體，每天06:30和19:30各飼喂1次。瘤胃液供體動物飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 體外發(fā)酵基質組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

表2 瘤胃液供體牛飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.2 試驗方法

采用兩步消化法，分別模擬瘤胃發(fā)酵和真胃消化過程[9]，測定體外瘤胃發(fā)酵參數及干物質消化率(DMD)和粗蛋白質消化率(CPD)。

1.2.1 模擬瘤胃發(fā)酵

于早晨飼喂后2 h，通過瘤胃瘺管分別從3頭牛的瘤胃中采集200 mL瘤胃液，混合均勻，然后用4層紗布過濾。根據Zhao等[10]的方法配制緩沖液。按照4∶1(體積比)的比例將緩沖液與瘤胃液在39 ℃水浴鍋中混合均勻，并持續(xù)通入二氧化碳氣體。以容積為50 mL的離心管作為發(fā)酵容器。準確稱取0.400 0 g風干發(fā)酵基質(表1)樣品置于每個離心管中。每個離心管注入40 mL緩沖液與瘤胃液的混合液，蓋上橡皮塞。橡皮塞上裝有1支玻璃滴管，滴管的吸球上留有一條縫隙，以釋放發(fā)酵過程中產生的氣體。然后放入溫度為39 ℃的生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)發(fā)酵。發(fā)酵48 h后，按放入順序依次取出離心管，置于冰上，終止發(fā)酵。用低溫高速離心機(TGL 20M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)在4 ℃和1 800×g條件下，將培養(yǎng)液離心15 min。取上清液，用酸度計(pH-HJ 90，北京航天計算機集團有限公司)測定pH，然后放置在-20 ℃的冰柜中冷凍保存。離心沉淀用于模擬真胃消化過程。

1.2.2 模擬真胃消化

將2.0 g胃蛋白酶(15 000 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于850 mL去離子水中，加入100 mL 1 mol/L鹽酸(HCl)，稀釋至1 L，配制成胃蛋白酶溶液，該溶液中胃蛋白酶活性為30 000 U/mL。向體外瘤胃發(fā)酵的離心沉淀中加入40 mL新配制的胃蛋白酶溶液，然后將培養(yǎng)管放置在溫度為38 ℃的生化培養(yǎng)箱中進行消化，并不時搖晃混勻。消化48 h后，將樣品在4 ℃和1 800×g條件下離心(TGL 20M臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)15 min。分別收集上清液和離心沉淀，放置于-20 ℃的冰柜中冷凍保存。

1.3 試驗設計

本研究分為3個試驗。每個試驗均設置4個處理，每個處理設置8個重復，另外設置3個空白。STE和PEG的添加量均以干物質為基礎。試驗1：分別向發(fā)酵基質中添加0、0.50%、1.00%、2.00% STE作為試驗處理，模擬體外瘤胃發(fā)酵和真胃消化過程。測定體外瘤胃發(fā)酵參數pH、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度及兩步消化過程后的體外DMD和CPD；試驗2：在向發(fā)酵基質中添加1.50% STE的基礎上，分別添加0、0.75%、1.50%、3.00% PEG作為試驗處理，試驗方法、過程及測定指標均與試驗一相同；試驗3：試驗處理分為不添加STE和PEG(對照)、瘤胃發(fā)酵階段添加1.50% STE、瘤胃發(fā)酵階段添加1.50% STE和3.00% PEG、瘤胃發(fā)酵階段添加1.50% STE+真胃消化階段添加3.00% PEG，試驗方法、過程均與試驗1相同，測定指標為兩步消化過程后的體外DMD和CPD。

1.4 指標測定

根據AOAC(1990)[11]的方法測定發(fā)酵基質及瘤胃液供體牛飼糧的干物質和粗蛋白質含量。根據 Van Soest等[12]的方法，應用ANKOM200纖維測定儀(A200i，美國Ankom科技公司)測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。根據Broderick等[13]的苯酚次氯酸鈉比色法，應用分光光度計(UV-1801，北京北分瑞利儀器有限公司)測定培養(yǎng)液中NH3-N濃度。應用氣相色譜儀(TP-2060F，北京北分天普儀器技術有限公司)測定培養(yǎng)液中VFA濃度，計算總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度。

1.5 數據統(tǒng)計分析

應用Excel 2007對數據進行初步處理，然后應用SAS 9.4 (2013)軟件中的one-way ANOVA程序對數據進行方差分析，采用Duncan氏法對各處理指標進行多重比較。以P<0.05作為差異顯著的判斷標準，以0.05≤P<0.10作為有變化趨勢的標準。

2 結果與分析

2.1 STE對體外瘤胃發(fā)酵參數及營養(yǎng)物質消化率的影響

表3中結果顯示，添加STE對培養(yǎng)液的pH沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50%和1.00% STE顯著降低了培養(yǎng)液中TVFA濃度(P<0.05)，但是添加2.00% STE對TVFA濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50% STE顯著降低了培養(yǎng)液中乙酸、丙酸和丁酸濃度(P<0.05)，但是添加1.00%和2.00% STE對乙酸、丙酸和丁酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加2.00% STE顯著降低了培養(yǎng)液中戊酸濃度(P<0.05)，但是添加0.50%和1.00% STE對戊酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50%、1.00%和2.00% STE均顯著降低了培養(yǎng)液中異戊酸濃度(P<0.05)。不同添加量的STE導致培養(yǎng)液中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度均呈現先降低后升高的二次曲線變化(P<0.05)，并導致異丁酸、戊酸和異戊酸濃度均呈現線性下降(P<0.05)，但對乙酸/丙酸及NH3-N濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50%、1.00%和2.00% STE均顯著降低了體外DMD和CPD(P<0.05)，并且導致體外DMD和CPD呈現線性和二次曲線變化(P<0.05)。

表3 STE對體外瘤胃發(fā)酵參數及營養(yǎng)物質消化率的影響(試驗1)

2.2 PEG協同STE對體外瘤胃發(fā)酵參數及營養(yǎng)物質消化率的影響

表4中結果顯示，在發(fā)酵基質中含有1.50% STE的條件下，添加0.75% PEG顯著降低了培養(yǎng)液中TVFA、乙酸及丁酸濃度(P<0.05)，但是添加1.50%和3.00% PEG對TVFA、乙酸及丁酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.75%、1.50%和3.00% PEG對培養(yǎng)液的pH和丙酸、異丁酸濃度及乙酸/丙酸沒有顯著影響(P>0.05)。隨著PEG添加量的增加，培養(yǎng)液中TVFA和NH3-N濃度線性升高(P<0.05)，乙酸濃度呈先下降再升高的二次曲線變化(P<0.05)，戊酸(P=0.088)和異戊酸(P=0.067)濃度具有線性升高的趨勢。在發(fā)酵基質中含有1.50% STE的條件下，添加0.75%、1.50%和3.00% PEG對體外DMD沒有顯著影響(P<0.05)，但是具有線性提高體外CPD的趨勢(P=0.089)。

2.3 PEG添加途徑對體外DMD和CPD的影響

表5中結果顯示，添加1.50% STE顯著降低了體外DMD(P<0.05)。在瘤胃發(fā)酵階段或者真胃消化階段添加3.0%PEG對STE抑制體外DMD的影響均沒有緩解作用。添加1.50% STE顯著降低了體外CPD(P<0.05)。在瘤胃發(fā)酵階段或者真胃消化階段添加3.0%PEG均緩解了STE對體外CPD的抑制作用。

3 討 論

瘤胃液pH是反映瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標。正常飼養(yǎng)管理條件下，成年牛的瘤胃液pH為5.5～7.0。Yildiz等[14]研究表明，在綿羊飼糧中添加185和370 g/d橡樹縮合單寧提取物對瘤胃液pH沒有顯著影響。在本試驗中，向發(fā)酵基質中添加不同水平的STE對培養(yǎng)液的pH沒有顯著影響，與前人研究結果一致。

表4 PEG協同STE對體外瘤胃發(fā)酵參數及營養(yǎng)物質消化率的影響(試驗2)

表5 PEG添加途徑對體外DMD和CPD的影響(試驗3)

飼糧中的碳水化合物在瘤胃可以被發(fā)酵產生乙酸、丙酸、丁酸等VFA。VFA通過消化道吸收后被反芻動物利用，是反芻動物的主要能量來源[15]。本試驗結果顯示，添加STE降低了培養(yǎng)液中TVFA濃度，而添加PEG則提高了培養(yǎng)液中TVFA濃度。這表明STE能夠抑制飼糧中碳水化合物的發(fā)酵，因而降低了TVFA的濃度。

前人研究結果顯示，飼糧中添加銀合歡縮合單寧降低了培養(yǎng)液中原蟲的數量[16]，飼糧中添加雞眼草縮合單寧降低了山羊瘤胃液中原蟲的數量[17]，而飼糧中添加單寧酸也降低了肉牛瘤胃中原蟲的相對豐度[4]。這些研究結果表明，縮合單寧和水解單寧均能夠降低瘤胃液中原蟲數量。還有研究顯示，飼糧中添加漆樹水解單寧能夠降低瘤胃中產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的相對豐度[18]。瘤胃原蟲及產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌對于碳水化合物在瘤胃中的發(fā)酵具有重要作用，因此，本研究中STE降低培養(yǎng)液中TVFA濃度的原因可能是通過抑制瘤胃原蟲和部分瘤胃細菌的生長和活動造成的結果。由于本研究沒有測定瘤胃微生物區(qū)系變化情況，STE究竟抑制了哪些瘤胃微生物的生長和活動還需要進一步研究。STE對培養(yǎng)液中不同VFA的影響不同，可能是STE對不同瘤胃微生物的作用不同所造成的。本研究結果顯示，在發(fā)酵基質中含有STE的條件下，添加PEG能夠提高培養(yǎng)液中TVFA濃度。導致這一結果的原因可能是PEG與STE結合，緩解了STE對碳水化合物發(fā)酵的抑制作用。

Beauchemin等[19]研究結果顯示，飼糧中添加1%和2%(干物質基礎)的白堅木單寧提取物，使肉牛瘤胃液的NH3-N濃度線性降低。Yang等[4]研究結果表明，肉牛飼糧中添加13.0 或26.0 g/kg的單寧酸顯著降低了瘤胃液的NH3-N濃度，而添加6.5 g/kg的單寧酸則對瘤胃液NH3-N濃度沒有顯著影響。單寧降低瘤胃液NH3-N濃度的原因可能有2個方面：一是單寧與蛋白質結合形成了復合物，抑制了蛋白質的降解；二是單寧抑制了瘤胃中蛋白質降解菌的活性。而本研究中試驗1的結果顯示，添加2.00%以下的STE對培養(yǎng)液中NH3-N濃度沒有顯著影響。蛋白質降解提高NH3-N濃度，而微生物蛋白合成降低NH3-N濃度。因此，這可能是STE抑制了蛋白質的降解，同時抑制了瘤胃微生物蛋白合成造成的。由于本研究的試驗1沒有測定蛋白質降解率和微生物蛋白合成量，因此，不能確定添加STE沒有影響培養(yǎng)液中NH3-N濃度的確切原因。

Arisya等[20]研究了栗樹單寧提取物、朱纓花單寧提取物及毛野牡丹單寧提取物對體外瘤胃發(fā)酵飼糧粗蛋白質降解率的影響。結果表明，飼糧中添加2%(干物質基礎)不同來源的單寧提取物均降低了飼糧干物質和粗蛋白質的降解率。Yang等[4]向肉牛飼糧中添加26.0 g/kg DM單寧酸也顯著降低了飼糧的干物質、有機物、粗蛋白質的全消化道消化率。本試驗結果顯示，向發(fā)酵基質中添加0.50%、1.00%、2.00% STE均降低了體外DMD和CPD，這與Arisya等[20]和Yang等[4]的研究結果一致。STE降低DMD和CPD的原因可能是在瘤胃發(fā)酵階段單寧與飼糧蛋白質結合形成了復合物，而在真胃消化階段這種復合物沒有被有效解離，因而降低了CPD和DMD。而本研究結果顯示，在瘤胃發(fā)酵階段或真胃消化階段添加PEG均提高了體外CPD。這可能是在瘤胃發(fā)酵階段，PEG與STE結合減少了STE與蛋白質結合的機會，因而提高了CPD。而本研究中試驗2的結果顯示，在發(fā)酵基質中含有STE的條件下，添加PEG提高了培養(yǎng)液中NH3-N濃度。這與劉艷玲[21]的研究結果及本研究中添加PEG提高體外CPD的結果一致。關于PEG在真胃消化階段能否促進單寧-蛋白質復合物的解離，還需要進一步開展動物試驗進行研究。

4 結 論

① STE抑制碳水化合物在體外瘤胃中的發(fā)酵，降低培養(yǎng)液中TVFA濃度，并降低體外DMD和CPD。

② 在瘤胃發(fā)酵階段或者真胃消化階段添加PEG均能夠緩解STE對營養(yǎng)物質消化造成的抑制作用，提高體外DMD。在瘤胃發(fā)酵階段添加PEG能夠同時提高體外DMD和CPD。