銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵物對肉雞抗氧化能力和胸肌肉品質(zhì)的影響

曹銀娣 張旭暉 孫智遠(yuǎn) 汪貴斌 曹福亮*

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210037；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，青島266109；3.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，句容212400)

由于畜禽類飼糧全面禁抗政策的實施，化學(xué)合成抗氧化劑對人類健康亦有潛在威脅，人們將視角轉(zhuǎn)向可飼用天然產(chǎn)物飼料添加劑的開發(fā)[1]。目前，將銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵物(GEL)作為飼料添加劑，研究其對肉雞生長性能和抗氧化等方面的研究報道在國內(nèi)外都比較少[2]。在畜牧生產(chǎn)中，微生物發(fā)酵是一種從植物產(chǎn)品中去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的有效手段，同時是能夠產(chǎn)生具有生物活性物質(zhì)的有效途徑，可以促進(jìn)動物的生長和健康。大量研究發(fā)現(xiàn)，功能性植物資源作為飼料添加劑能夠增強(qiáng)動物機(jī)體的抗氧化能力[3-4]，改善肉品風(fēng)味，顯著提高肉品質(zhì)。近年來大量研究表明，以植物資源如杜仲、銀杏、辣木、黃芪等為原料生產(chǎn)功能性添加劑，添加到動物飼糧中，可以有效改善動物的生產(chǎn)性能，減少氧化損傷[5-8]，并提高肉品質(zhì)[9-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵銀杏葉可以提高肉雞的抗氧化能力，改善肌肉系水力和肉品質(zhì)[12-14]。

發(fā)酵過程中，微生物將銀杏-杜仲葉復(fù)合原料中不易消化吸收的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化變成小分子，容易被腸黏膜吸收，加速血液中的有效成分達(dá)到有效濃度，從而提高動物的生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)。本試驗選用愛拔益加(AA)肉雞作為研究對象，研究飼糧中添加不同水平的GEL對肉雞抗氧化功能和肉品質(zhì)的影響，并設(shè)未發(fā)酵物[未發(fā)酵銀杏-杜仲葉(NGEL)]組作為對照，為銀杏-杜仲葉生物飼料添加劑用于肉雞生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GEL的制備

1)10月份于南京林業(yè)大學(xué)銀杏園采摘的銀杏葉，自然晾曬，備用；12月份于河南理工大學(xué)杜仲園收集的杜仲落葉，自然晾曬，備用；

2)分別將銀杏葉和杜仲葉60 ℃烘干，磨粉過40目篩，裝入自封袋密封保存；

3)接種2.0%黑曲霉菌和1.0%產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵銀杏葉和杜仲葉配比為2∶1的復(fù)合物，添加麩皮20%(g/g總干料)，含3.0%(NH4)2SO4、2.0%葡萄糖、2.0% KH2PO4、0.5% MgSO4·7H2O，物料初始pH為5，濕度為60%，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為96 h。

通過黑曲霉和產(chǎn)阮假絲酵母生物轉(zhuǎn)化后的GEL，營養(yǎng)豐富，總黃酮和綠原酸含量達(dá)到最優(yōu)，分別由發(fā)酵前的1.67%和0.42%提高至2.13%和0.50%，提高幅度為27.55%和19.48%。代謝能為13.15 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)含量為25.23%。

1.2 試驗動物

選取1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞360只(由山東煙臺蘇佳麗禽業(yè)有限公司提供)，平均體重為(49.24±3.89) g，差異不顯著(P>0.05)。

1.3 試驗設(shè)計與飼糧

選取360只1日齡的健康A(chǔ)A肉雞，隨機(jī)分成6組，即對照組、NGEL組[在基礎(chǔ)飼糧中添加NGEL，前期(1～21日齡)添加0.3%，后期(22～24日齡)添加0.6%]及4個GEL組(GEL1、GEL2、GEL3、GEL4組，即在基礎(chǔ)飼糧中添加GEL，前期GEL分別添加0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，后期分別添加0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞。試驗期42 d。采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗采用重量替代法，用麩皮在不同的飼糧中補(bǔ)齊試驗添加物的量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 樣品的采集與制備

分別于21、42日齡08:00開始進(jìn)行采樣。前1天19：00開始斷糧，保持飲水供應(yīng)。每組中每個重復(fù)取1只雞，每組共6只，先進(jìn)行稱重，后采用5 mL離心管進(jìn)行頸靜脈采血，并于低溫3 500 r/min離心15 min制備血清，置-20 ℃冰箱保存，待測。在每只雞的大體一致的相應(yīng)部位采集胸肌樣品，去除脂肪和結(jié)締組織，每只雞各取4塊，分別用于測定24和48 h的滴水損失(10 g)、45 min和24 h的pH(50 g)、肉色(15 g)、烹飪損失和嫩度(剪切力)(30 g)。

1.5 抗氧化指標(biāo)的測定

1.5.1 血清中α-生育酚(α-TOH)含量的測定

采用Kayden等[15]的方法測定血清α-TOH的含量。取100 μL血清樣品與2.0%連苯三酚充分混勻，置70 ℃的恒溫振蕩水浴中2 min；加入3.6 mmol/L KOH 0.25 mL，再置70 ℃恒溫振蕩水浴中30 min。冰水浴冷卻后，加入正己烷2 mL和蒸餾水0.5 mL，2 min劇烈振蕩，將1 mL最上層的正己烷α-TOH抽提液轉(zhuǎn)移至4 mL玻璃試管中，制備1、2、4、6、8和10 μg/mL的α-TOH標(biāo)準(zhǔn)品，分別加2.0%菲羅啉200 μL到樣品管和標(biāo)準(zhǔn)品管中，充分混勻，再加1 mmol/L FeCl3200 μL，1 min渦旋混勻，再加H3PO4200 μL，渦旋混勻，在534 nm處比色法讀取吸光值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的α-TOH含量。

1.5.2 血清和組織中抗氧化與脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清、肝臟和胸肌中丙二醛(MDA)含量；按Noguchi等[16]的方法測定血清和肝臟中還原型谷胱甘肽(GSH)含量及胸肌中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；根據(jù)鐵離子(Fe3+)還原法測定胸肌總抗氧化能力(T-AOC)；使用黃嘌呤氧化法測定胸肌總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 胸腿肌肉品質(zhì)的測定

1.6.1 pH的測定

分別于45 min和24 h時，用嫩度儀取樣器在備存肉樣上鉆1個小孔，將用便攜式數(shù)顯pH計的電極直接插入小孔中，使電極頭完全被包埋在肉樣中，讀取pH(pH45 min和pH24 h)。每測1個樣品后，均用蒸餾水充分沖洗電極，并注意校正。

1.6.2 系水力的測定

烹飪損失：每個樣取胸肌約10 g(M)，用錫箔紙包住，置75 ℃水中煮15 min，稱重(m)。

烹飪損失(%)=[(M-m)/M]×100。

滴水損失：分別取胸肌約10 g，稱重(W1)，置于充氣的塑料袋中，封口，避免肌肉塊貼壁，吊掛于4 ℃冰箱內(nèi)，24 h后取出胸肌，拭去肌肉表面水分，稱重(W2)。

24 h滴水損失(%)=[(W1-W2)/W1]×100。

稱量后的肉樣重新放入充氣的塑料袋中，封口，掛回4 ℃冰箱，經(jīng)24 h再取出肉樣，擦干肉樣表層水分，稱重(W3)。

48 h滴水損失(%)=[(W1-W3)/W1]×100。

1.6.3 胸肌剪切力(嫩度)的測定

將沿左側(cè)胸肌取的樣品，去除肉樣表面附著的脂肪及多余的結(jié)締組織，于塑料袋中密封，在溫度15～16 ℃下進(jìn)行尸僵前處理24 h。4 ℃下再熟化24 h。取出熟化充分的肉樣，室溫放置1 h，解除塑料袋包裝，將溫度計插入肌肉中心部，然后包扎好，袋口朝上，置于80 ℃水浴鍋中，進(jìn)行加熱，當(dāng)肌肉中心溫度達(dá)到70 ℃時，取出肉樣，冷卻至室溫。將每塊肌肉沿肌纖維方向修成1 cm×1 cm×3 cm的長條，3～5塊，測定剪切力3次(Salter剪切力儀，G2R Elec. Mf g. Co.)，取平均值。

1.6.4 肉色評定

分別取出肉樣，沿肌纖維方向，切取2 cm×2 cm的胸肌樣品，用色差儀(CHROMA METER CR-400, KONZCAminOLTA SENSING, INC,日本)測定亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值。

1.6.5 胸肌脂肪酸含量的測定

分別稱取0.2 g經(jīng)過凍干處理的樣品，放入試管中；加內(nèi)標(biāo)1 mL，加NaHCO3/甲醇溶液4 mL，混勻，50 ℃放20 min后，加鹽酸/甲醇溶液2 mL，80 ℃下孵育1 h；充分振蕩；冷至室溫，先后加入水2 mL和正己烷6 mL，充分振蕩，離心分層；取200 μL上層溶液，加600 μL正己烷，用氣相色譜儀進(jìn)行分析。

GC-14C氣相色譜儀：附帶N-2000雙通道色譜工作站軟件(浙江大學(xué)智能信息工程有限公司)；色譜柱：長30 m，內(nèi)徑0.22 mm，柱溫195 ℃；載氣：氫氣流速22.5 mL/min，空氣流速80 mL/min，氮?dú)饬魉? mL/min；進(jìn)樣器溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：0.5～1.0 μL；分流比60∶1。

總脂肪酸含量(mg/g)=(峰總體積-內(nèi)標(biāo)體積)/
內(nèi)標(biāo)體積×(內(nèi)標(biāo)重量，mg/g
樣品的干重)[17]。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010整理后，采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，最后采用SPSS 22.0軟件做線性回歸分析，差異顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 GEL對肉雞血清α-TOH含量的影響

由圖1可知，GEL1、GEL2、GEL3和GEL4組血清α-TOH含量分別比對照組提高了9.43%、20.54%、35.02%和57.24%，這4組分別比NGEL組提高了7.62%、18.54%、32.78%和54.64%；且GEL3和GEL4組均顯著高于對照組和NGEL組(P<0.05)；線性回歸分析結(jié)果表明，隨著飼糧GEL添加水平的提高，血清α-TOH含量呈顯著線性增加(P<0.05)。

2.2 GEL對肉雞血清和肝臟GSH含量的影響

由圖2可知，與對照組相比，4個GEL組的血清GSH含量分別顯著提高了14.10%、23.50%、25.21%和24.35%(P<0.05)，而各GEL組間均無顯著差異(P>0.05)；GEL2、GEL3和GEL4組的肝臟GSH含量最高，分別比對照組和NGEL組提高了33.24%、32.97%、32.42%和24.68%、24.42%、23.92%(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖2 飼糧添加GEL對肉雞血清和肝臟GSH含量的影響

2.3 GEL對肉雞血清和肝臟MDA含量的影響

由圖3所示，飼糧添加GEL對血清和肝臟MDA含量的影響趨勢是一致的。與對照組和NGEL組相比，GEL2、GEL3、GEL4組的血清或肝臟的MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

2.4 GEL對肉雞胸肌抗氧化與脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響

由表2可知，隨著飼糧中GEL添加水平的增加，胸肌中T-SOD的活性和T-AOC呈線性增加，而MDA含量呈線性降低；GEL2、GEL3和GEL4組胸肌中T-SOD活性顯著高于對照組和NGEL組(P<0.05)，而各組間的胸肌GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)；就胸肌中T-AOC而言，GEL2、GEL3和GEL4組顯著高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，不同的飼糧處理均對胸肌MDA含量產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，GEL3組的胸肌MDA含量顯著低于NGEL組和GEL1組(P<0.05)。

2.5 GEL對肉雞胸肌肉品質(zhì)的影響

由表3可知，飼糧中添加GEL對胸肌的pH24 h、24和48 h的滴水損失、48 h的烹飪損失和剪切力均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。同時，隨飼糧GEL添加水平的增加，24 h滴水損失、48 h滴水損失和剪切力呈顯著線性降低(P=0.021和P=0.039、P=0.016)；同時，GEL2、GEL3和GEL4組的剪切力、24 h滴水損失和48 h滴水損失顯著低于對照組(P<0.05)。GEL2和GEL3組的烹飪損失顯著低于對照組(P<0.05)。

圖3 飼糧添加GEL對肉雞血清和肝臟MDA含量的影響

表2 飼糧添加GEL對肉雞胸肌抗氧化和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響

表3 飼糧添加GEL對肉雞胸肌肉品質(zhì)的影響

2.6 GEL對肉雞胸肌脂肪酸組成的影響

如表4可見，飼糧處理對C16∶0(P=0.033)、C18∶0(P=0.001)、C18∶2(P=0.001)、C18∶3(P=0.001)、C20∶4(P=0.001)和總多不飽和脂肪酸(PUFA)(P=0.001)含量產(chǎn)生了顯著影響。與對照組或NGEL組相比，GEL2、GEL3和GEL4組的胸肌C16∶0和C18∶0含量顯著降低(P<0.05)，就總PUFA、C18∶2、C18∶3和C20∶4含量而言，4個GEL組均比對照組和NGEL組有顯著升高(P<0.05)，同時，GEL3、GEL4組與GEL1組間的總PUFA、C18∶2、C18∶3和C20∶4含量均有顯著差異(P<0.05)；隨著飼糧中GEL添加水平的增加，C16∶0(P=0.033)、C18∶0(P=0.001)和總飽和脂肪酸(P=0.041)含量呈顯著線性降低(P<0.05)，而總PUFA、C18∶2、C18∶3和C20∶4含量呈顯著線性增加(P<0.05)。

表4 飼糧添加GEL對肉雞胸肌脂肪酸組成的影響

3 討 論

3.1 GEL對肉雞生長性能和抗氧化功能的影響

發(fā)酵是飼糧生產(chǎn)中常用的一種處理工藝，通過微生物可產(chǎn)生具有促進(jìn)健康作用的生物活性物質(zhì)。經(jīng)過微生物發(fā)酵處理的植物資源，含有豐富的酶、維生素和生長因子[18]，銀杏黃酮甙元在發(fā)酵后更容易被動物腸道消化吸收[19]。本試驗已發(fā)表數(shù)據(jù)揭示了飼糧中添加GEL能夠顯著提高肉雞飼料效率，且有效改善腸道結(jié)構(gòu)，提高消化酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)腸道消化吸收功能，從而提高了肉雞的生長性能[20]。

抗氧化酶防御主要包括SOD、CAT和GSH-Px，它們在預(yù)防脂質(zhì)過氧化的有害影響方面起著重要作用[21]。MDA含量用于評估脂質(zhì)過氧化程度[22-23]。SOD是動物機(jī)體抗氧化損傷系統(tǒng)中的重要成員之一，在生物體內(nèi)它是一種以自由基為底物的酶，可以平衡氧化和抗氧化過程，通過SOD活性能夠間接反映機(jī)體清除自由基的能力。T-AOC能夠反映機(jī)體清除自由基的能力。就氧化還原而言，本試驗結(jié)果顯示，肉雞飼糧中添加不同水平的GEL能提高胸肌T-SOD活性和T-AOC，降低血清、肝臟及胸肌MDA的含量，這和GEL中的總黃酮、綠原酸對細(xì)胞自由基和抗氧化平衡的調(diào)控相關(guān)。黃酮類化合物是具有多種酚類結(jié)構(gòu)的一類天然物質(zhì)，酚類物質(zhì)具有很高的抗氧化活性，能夠通過穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基，起到抗氧化的作用[24-25]。

多不飽和脂肪酸的提高通常增加脂質(zhì)過氧化的水平。GSH參與細(xì)胞防御體系，是天然活性氧(ROS)在細(xì)胞內(nèi)的清除劑，可以保護(hù)組織不受氧化損傷，能夠有效防止脂肪酸過氧化[26-27]。作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，脂肪酸能夠介導(dǎo)細(xì)胞通訊、膜流動性、第二信使傳遞[28]。血清α-TOH和GSH含量隨著GEL添加水平的提高有顯著提高，原因可能是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的微生物酶類，作用于植物細(xì)胞壁，使具有抗氧化功能的酚類物質(zhì)釋放出來[29-30]。酚酐被β-葡萄糖苷酶分解成苷元，苷元具有親油性，有利于通過細(xì)胞膜磷脂雙層膜，所以很容易被上皮細(xì)胞吸收[29,31]。

3.2 GEL對肉雞肉品質(zhì)的影響

眾所周知，肌肉pH能夠影響多種肉質(zhì)特性，如肉色、嫩度、系水力(滴水損失和蒸煮損失)及其他肌肉性狀，是最重要的宰后因素之一。此外，屠宰后肉的pH迅速下降能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性，進(jìn)而導(dǎo)致肉色蒼白和系水力降低[24]。在本試驗中，屠宰后胸肌肉pH24 h隨著飼糧GEL添加水平的增加呈線性增加。該結(jié)果提示飼糧GEL能夠?qū)⑷獾膒H維持在相對較低的范圍內(nèi)。肉的系水力是直接與肌內(nèi)脂肪和水分含量相關(guān)的。較低的系水力說明通過滲出損失的營養(yǎng)成分較多，最終導(dǎo)致肉較干較硬。降低的pH能夠影響系水力。嫩度(剪切力)可能是決定消費(fèi)者對肉的可接受性的最重要的食用品質(zhì)指標(biāo)[32]。本試驗數(shù)據(jù)表明，系水力和剪切力的變化趨勢與pH是吻合的。杜仲葉中的綠原酸可以使細(xì)胞膜的脂質(zhì)層避免過氧化自由基的干擾，進(jìn)而減少細(xì)胞膜上的載體通道，減緩脂質(zhì)的過氧化，抑制亞鐵離子(Fe2+)誘導(dǎo)MDA的形成[33]，阻止肌肉過快氧化，降低肌肉滲水性和肌肉反光，維持胴體性狀及肉品質(zhì)的相對穩(wěn)定。飼糧中添加杜仲提取物能不同程度地降低肉產(chǎn)品的滴水損失，改善肉色和嫩度，增添肉的多汁性和風(fēng)味；此外，杜仲葉中含有蘇氨酸和蛋氨酸，它們能夠加快脂肪代謝、改善肉質(zhì)性狀[33]。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GEL能夠有效改變脂肪酸的組成，表現(xiàn)在增加或保護(hù)不飽和脂肪酸(UFA)的氧化，或降低胸肌總飽和脂肪酸(SFA)的含量。SFA含量的降低是由于C16∶0和C18∶0含量顯著降低所致，這可能與飼糧GEL的添加對血清膽固醇(TC)含量的降低作用有關(guān)[12]。由于胸肌中C18∶2、C18∶3和C20∶4含量的增加，胸肌中總PUFA含量顯著增加。這可能是由于過氧化物酶能夠降低總UFA氧化，它的活性增強(qiáng)，總PUFA含量就增加了。臨床數(shù)據(jù)顯示，冠狀心臟疾病(CHD)與飼糧TC和SFA的攝取呈顯著相關(guān)[26]。本試驗中，肉雞飼糧添加GEL后42 d，與對照組相比，其胸肌總SFA含量較低，且本試驗中，脂肪酸組成的結(jié)果與增強(qiáng)的T-AOC和增加的SOD活性的結(jié)果相互支持。

4 結(jié) 論

飼糧中添加GEL(前期添加0.2%～0.5%，后期添加0.4%～1.0%)可提高42日齡肉雞血清的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，改善胸肌品質(zhì)和脂肪酸組成。