CIH對(duì)仔鼠胰腺基因芯片測(cè)序及相關(guān)生物信息學(xué)的影響研究

黃 煌，許險(xiǎn)艷，許相洋，鄭 鳴，呂國(guó)榮，林逕蒼△

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州 362000;2.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福州 350004)

BARKER等[1-4]學(xué)者曾經(jīng)提出了成年人的某些疾病起源于胎兒的學(xué)說(shuō)，比如營(yíng)養(yǎng)、氧氣等環(huán)境因素作用于早期的胎兒發(fā)育，將程序性地控制成人期機(jī)體心血管疾病及代謝性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5]。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，宮內(nèi)慢性間斷性缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)模型可引起胎兒成年期發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的早期改變、子代心臟的表型改變、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等現(xiàn)象[6-9]。IR指的是機(jī)體內(nèi)正常劑量的胰島素，在和它的特異性受體結(jié)合后生物效應(yīng)低于正常的一種狀態(tài)[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)的高靈敏度、高通量、平行性等特性，建立CIH模型，對(duì)母體常氧和缺氧環(huán)境下出生的成年期雄性仔鼠胰腺全基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，分析其生物信息學(xué)的改變，深入研究IR的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)SD孕大鼠12只，體重(210±10)g，購(gòu)于福建省福州振和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)開發(fā)有限公司，許可證號(hào)：SCXK閩2018-0001。實(shí)驗(yàn)于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，許可證號(hào)：SYXK(閩)2008-0001。自制有機(jī)玻璃缺氧箱(60 cm×60 cm×60 cm)，壓縮氮?dú)?、氧?濃度大于99%)購(gòu)自福建省泉州協(xié)輝氣體有限公司，希瑪AR8100便攜式測(cè)氧儀、強(qiáng)生血糖儀、5%水合氯醛購(gòu)自福建省泉州第一醫(yī)院制劑室，大鼠空腹胰島素(FINS) ELISA試劑盒購(gòu)自上海瑞番生物科技有限公司，Gene Expression Wash Buffer1、2及TRIzol購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，另外還有生物質(zhì)粉碎機(jī)、研磨珠均質(zhì)器、雜交室等。

1.2 方法

1.2.1CIH模型的建立

根據(jù)前期建立動(dòng)物模型的方法[13-15]，12只孕齡7 d的SD大鼠分為兩組，即正常組和缺氧組，每組6只。將缺氧組孕鼠置于缺氧箱內(nèi)，氧濃度控制在(10.0±0.5)%，每天8 h，重復(fù)以上過(guò)程至分娩前1 d停止缺氧處理，待產(chǎn)孕鼠分籠。分娩后的第12周，每窩選取1只雄性仔鼠，心尖取血，雙抗夾心法檢測(cè)FINS，血糖儀檢測(cè)空腹血糖(FBG);麻醉后處死取胰腺于液氮中速凍待送檢。

1.2.2全基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)

大鼠胰腺的安捷倫全基因組寡核苷酸芯片檢測(cè)主要步驟:TRIzol法提取胰腺組織的總RNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，合成cDNA并標(biāo)記，檢測(cè)熒光標(biāo)記的效率，已標(biāo)記的探針與高密度基因組芯片進(jìn)行雜交，使用GenePIX4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，保存數(shù)據(jù)，并用Feature Extraction 軟件處理、分析數(shù)據(jù)。對(duì)于分光光度計(jì)評(píng)價(jià)總RNA純度：以260 nm處吸光度(A)值與280 nm處A值的比值(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.1表示總RNA的純度合格，或以A260 nm/A220 nm>1.8表示總RNA純度合格。使用t檢驗(yàn)分析差異表達(dá)顯著基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)：Fold Change≥2.0且P≤0.05，分析pathway 富集、判定GO(gene ontology)功能分類等。

1.2.3大鼠FINS、FBG的測(cè)定

分娩后第12周的雄性仔鼠采用鼠尾采血的方法，用強(qiáng)生血糖儀檢測(cè)FBG；FINS測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定。穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估胰島素抵抗(HOMA-IR) = (FBG×FINS)/22.5,評(píng)估胰島素抵抗能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血液相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

12周齡缺氧組雄性仔鼠FINS、FBG、以穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估胰島素抵抗(HOMA-IR)均高于正常組雄性仔鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 第12周雄性仔鼠血液相關(guān)指標(biāo)

2.2 總RNA的定量和質(zhì)量保證

正常組雄性仔鼠和缺氧組雄性仔鼠胰腺組織的總RNA的A260 nm/A280 nm為分別1.96及1.95，接近2.00；兩組總RNA的A260 nm/A220 nm分別為2.36及2.33，均大于1.8,提示實(shí)驗(yàn)提取的總RNA純度合格,兩組雄性仔鼠胰腺組織所提取的總RNA的濃度、體積、質(zhì)量見(jiàn)表2。

表2 ND-1000型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)胰腺組織mRNA的純度及濃度

2.3 基因芯片差異表達(dá)基因(DEGs)篩選

散點(diǎn)圖坐標(biāo)的X軸、Y 軸分別為正常組、缺氧組雄性仔鼠胰腺 cy3 熒光強(qiáng)度值。每一個(gè)基因的雜交信號(hào)用對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表，紅色信號(hào)代表缺氧組雄性仔鼠胰腺的某個(gè)基因較正常組雄性仔鼠胰腺信號(hào)值相對(duì)較強(qiáng)，基因表達(dá)上調(diào)；綠色代表的基因信號(hào)值相對(duì)較弱，基因表達(dá)下調(diào)；黑色代表基因表達(dá)無(wú)明顯差異性，見(jiàn)圖1。基因芯片共檢測(cè)胰腺23 088個(gè)基因，依照表達(dá)基因差異篩選的標(biāo)準(zhǔn)(Fold Change≥2.0且P≤0.05)，缺氧組雄性仔鼠胰腺與正常組雄性仔鼠胰腺比較有2 628個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(紅點(diǎn))，有2 321個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)(綠點(diǎn))。

圖1 基因芯片信號(hào)強(qiáng)度的散點(diǎn)圖

2.4 GO功能分類

2.4.1分子功能的分析

缺氧組雄性仔鼠較正常組雄性仔鼠胰腺DEGs，表達(dá)上調(diào)的主要集中于：跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)、無(wú)機(jī)分子實(shí)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、次級(jí)活性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等分子功能；表達(dá)下調(diào)的主要集中于：蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、含蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等分子功能。見(jiàn)圖2。

2.4.2細(xì)胞組分的分析

缺氧組雄性仔鼠較正常組雄性仔鼠胰腺DEGs，表達(dá)上調(diào)的主要集中于：質(zhì)膜、神經(jīng)元、神經(jīng)元投射等成分；表達(dá)下調(diào)的主要集中于：細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器等成分。見(jiàn)圖3。

2.4.3生物學(xué)過(guò)程的分析

缺氧組雄性仔鼠較正常組雄性仔鼠胰腺DEGs，表達(dá)上調(diào)的主要集中于：多細(xì)胞組織、系統(tǒng)開發(fā)、羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程； 表達(dá)下調(diào)的主要集中于：細(xì)胞代謝、有機(jī)物代謝等生物學(xué)過(guò)程。見(jiàn)圖4。

2.5 pathway 富集分析

缺氧組雄性仔鼠胰腺較正常組雄性仔鼠DEGs，表達(dá)上調(diào)的主要集中于：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、皮質(zhì)醇合成與分泌、胰島素分泌等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；表達(dá)下調(diào)的主要集中于：核糖體、剪接體、氧化磷酸化等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，見(jiàn)圖5。胰島素分泌通路的路徑圖見(jiàn)圖6，黃色標(biāo)記的節(jié)點(diǎn)與上調(diào)基因相關(guān)，綠色節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)差異不明顯。

A:表達(dá)上調(diào)的分子功能；B:表達(dá)下調(diào)的分子功能。

A:表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞組分；B:表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞組分。

A:表達(dá)上調(diào)的生物學(xué)過(guò)程；B:表達(dá)下調(diào)的生物學(xué)過(guò)程。

A:表達(dá)上調(diào)的pathway；B:表達(dá)下調(diào)的pathway。

圖6 胰島素分泌通路

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 驗(yàn)證基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的可靠性

為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)譜的可靠性，用RT-PCR方法定量檢測(cè)缺氧組雄性仔鼠胰腺與正常組雄性仔鼠胰腺中的胰島素分泌通路的IRS、PKA、PHA、TC10、P13K、AMPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用2-ΔΔCt代表mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。缺氧組雄性仔鼠IRS、PKA、PHA、TC10、P13K、AMPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平較正常組雄性仔鼠胰腺均上調(diào)，見(jiàn)圖7，mRNA表達(dá)趨勢(shì)與基因芯片數(shù)據(jù)相互吻合。

圖7 幾個(gè)差異表達(dá)基因mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

BARKER等[1-4]提出了“成人疾病胎兒起源學(xué)說(shuō)”，在胚胎發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期,如果胎兒受到的不良因素刺激,胎兒將進(jìn)行必要的生存適應(yīng)，使處于敏感期胚胎的組織器官在結(jié)構(gòu)與功能上發(fā)生程序性改變，如持續(xù)至出生后將增強(qiáng)其成年期某些慢性疾病的易感性。充足的氧氣供應(yīng)及體內(nèi)氧環(huán)境穩(wěn)定是胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和保持組織結(jié)構(gòu)完整的條件。高海拔地區(qū)的孕婦可引起胎兒缺氧，另外長(zhǎng)期一氧化碳環(huán)境污染暴露、被動(dòng)吸煙、吸煙等因素也可導(dǎo)致胚胎慢性缺氧。此外，孕期因素，如心力衰竭、妊娠高血壓疾病、先兆子癇、貧血、腎功能衰竭及臍帶、胎盤因素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足均有可能引發(fā)孕婦缺氧，進(jìn)而引起胎兒缺氧。綜上，缺氧為臨床上胎兒遭受到的最常見(jiàn)的應(yīng)激反應(yīng)之一。

基因芯片作為是生物芯片的一種，原理是運(yùn)用計(jì)算機(jī)芯片集成化特征,使用微加工技術(shù),將特定的基因序列探針固定于支持物上，有序地排成二維DNA探針陣列，形成微觀檢測(cè)的器件，根據(jù)分子生物學(xué)核酸互補(bǔ)的特點(diǎn),把被標(biāo)記樣品與DNA探針陣列雜交，檢測(cè)雜交信號(hào)，最后對(duì)生物樣品進(jìn)行診斷[16-19]。該技術(shù)有快速、髙效等特點(diǎn),可整體、全面地研究基因組內(nèi)多個(gè)基因的變化,提供相關(guān)基因組學(xué)數(shù)據(jù),是探索疾病相關(guān)聯(lián)基因的有效手段。應(yīng)用此技術(shù)篩選孕母鼠缺氧對(duì)仔鼠胰腺基因表達(dá)的影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基因芯片共檢測(cè)胰腺23 088個(gè)基因，依照表達(dá)基因差異篩選的標(biāo)準(zhǔn)，缺氧組雄性仔鼠胰腺較正常組雄性仔鼠胰腺有2 628個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，下調(diào)有2 321個(gè)基因。為驗(yàn)證基因芯片的可靠性，用RT-PCR方法定量檢測(cè)缺氧組與正常組雄性仔鼠胰腺中的胰島素分泌通路的IRS、PKA、PHA TC10、P13K、AMPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平， mRNA表達(dá)趨勢(shì)與基因芯片數(shù)據(jù)相互吻合，證實(shí)了基因芯片數(shù)據(jù)的有效性。

從GO功能分類的分子功能分析：缺氧組雄性仔鼠胰腺較正常組仔鼠胰腺DEGs表達(dá)上調(diào)的主要集中于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)、無(wú)機(jī)分子實(shí)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、次級(jí)活性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等方面；表達(dá)下調(diào)的主要集中于蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、含蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等方面。從細(xì)胞組分分析：缺氧組雄性仔鼠胰腺較正常組仔鼠胰腺DEGs表達(dá)上調(diào)的主要集中于質(zhì)膜、神經(jīng)元、神經(jīng)元投射等成分；表達(dá)下調(diào)的主要集中于細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器等部分。從生物學(xué)過(guò)程方面分析：缺氧組雄性仔鼠胰腺較正常組仔鼠胰腺DEGs表達(dá)上調(diào)的主要集中于多細(xì)胞組織、系統(tǒng)開發(fā)、羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程；表達(dá)下調(diào)的主要集中于細(xì)胞代謝、有機(jī)物代謝等生物學(xué)過(guò)程。

pathway 富集分析顯示缺氧組雄性仔鼠胰腺較正常組仔鼠胰腺DEGs表達(dá)上調(diào)的主要集中的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、皮質(zhì)醇合成與分泌、胰島素分泌等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；表達(dá)下調(diào)的主要集中于核糖體、剪接體、氧化磷酸化等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

本研究通過(guò)建立SD大鼠妊娠期CIH模型來(lái)模擬孕期所經(jīng)歷的缺氧狀態(tài)，缺氧組12周雄性仔鼠的FINS、FBG、HOMA-IR mRNA均高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此推測(cè)CIH可致缺氧組雄性仔鼠成年后發(fā)生IR。IR可導(dǎo)致脂代謝紊亂、2型糖尿病、糖耐量異常、肥胖及代謝綜合征等。

由pathway 富集分析胰島素分泌通路的路徑圖可看出胰島素分泌通路36個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，與實(shí)驗(yàn)中CIH可導(dǎo)致缺氧組雄性仔鼠成年后發(fā)生IR的結(jié)果一致。

綜上所述， 妊娠期缺氧可導(dǎo)致成年雄性仔鼠胰腺表達(dá)基因、GO功能、胰島素分泌等pathway富集轉(zhuǎn)錄通路等失調(diào)，成年雄性仔鼠呈現(xiàn)IR。