基于新型納米傳感材料的DNA生物傳感器的應(yīng)用

聶 彤，許煒璇，歐靜純，李秋娜，賴婷婷，朱彩君，楊劍萍

(廣東第二師范學(xué)院 化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

DNA檢測可用于分子生物學(xué)研究和遺傳病的診斷。隨著現(xiàn)代電化學(xué)技術(shù)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，具有超靈敏度和高選擇性的DNA生物傳感器應(yīng)運(yùn)而生[1]。生物傳感器是將生物識別元件與適當(dāng)?shù)男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)元件組合在一起用來可逆和選擇性地檢測各種樣品中生物化學(xué)物質(zhì)的濃度或活性的裝置。而DNA生物傳感器的設(shè)計(jì)原理是分子之間的特異性識別，即檢測的是核酸的雜交反應(yīng)。不同生物的體內(nèi)具有其獨(dú)特的核酸序列，因而設(shè)計(jì)一段具有良好特異性、敏感性的寡核苷酸序列作為探針是檢測特定核酸序列的關(guān)鍵。它的組成包括信號換能器和目標(biāo)分子識別層[2]，識別層一般由換能器上的探針與輔助物質(zhì)組合而成，當(dāng)其與靶序列進(jìn)行特異性雜交時(shí)，換能器根據(jù)雜交所產(chǎn)生的變化可轉(zhuǎn)變?yōu)榭勺R別的信號，并根據(jù)雜交前后信號量的變化，對靶DNA進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。DNA生物傳感器主要應(yīng)用于DNA、酶和有機(jī)小分子的研究，還常用來檢測金屬離子，如汞離子。它是近年發(fā)展起來的一種基于納米材料的新型生物傳感器，具有高靈敏度和選擇性，吸引了生命科學(xué)領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注。

1 納米傳感材料

1.1 納米傳感材料的簡介

納米材料是指結(jié)構(gòu)尺寸介于1～100 nm范圍內(nèi)的材料，具有表面效應(yīng)、量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等與宏觀物體截然不同的特征，并表現(xiàn)出一系列與本體有顯著差異的性質(zhì)，如光學(xué)、磁學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)、電學(xué)、良好的生物兼容性以及催化性能[3]。

1.2 納米傳感材料的用途

納米材料傳感器具有高化學(xué)適應(yīng)性、易于合成、高靈敏度等特性。一般情況下，以納米材料為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物傳感器被稱為納米生物傳感器，其響應(yīng)速度快、體積小、靈敏度高且可移植。納米傳感材料還為DNA生物傳感器提供了一個(gè)有趣的平臺(tái)，可分析生物片段的內(nèi)容、將生物反應(yīng)轉(zhuǎn)換成電子信號、提供最短的檢測路徑，因而電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度、重現(xiàn)性和選擇性等得到顯著提升。

2 生物傳感器

2.1 基于石墨烯的生物傳感器

石墨烯是由碳原子以sp2雜化形式構(gòu)成的六元

環(huán)結(jié)構(gòu)緊密排列組成的二維的碳原子蜂窩狀結(jié)構(gòu)[4]，自2004年被發(fā)現(xiàn)后[5]，便引起了極大的關(guān)注。其獨(dú)特的理化性質(zhì)如：高的表面體積比、高電導(dǎo)率、生物相容性和堅(jiān)固的機(jī)械強(qiáng)度等[6-7]，使其在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。近年來由于石墨烯可作為生物識別位點(diǎn)[8]，且可用于原位標(biāo)記DNA[9]，基于石墨烯的DNA生物傳感器的研發(fā)受到研究人員的極大青睞。

EISSA和ZOUROB[1]研發(fā)了一個(gè)基于石墨烯的適配體生物傳感器，他們利用DNA在石墨烯表面的強(qiáng)吸附能力，將DNA核酸適配體結(jié)合在被石墨烯修飾的絲網(wǎng)印刷電極上，實(shí)現(xiàn)了對β-乳球蛋白體外無標(biāo)記檢測(見圖1)，用于牛奶過敏原的快速篩查。CHEN等[9]使用改性納米復(fù)合材料制備了一種新型DNA生物傳感器，他們在氮摻雜的石墨烯(NG)水凝膠上均勻沉淀了Fe3O4納米粒子，極大的促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移，且由于Fe3O4納米粒子與NG的協(xié)同作用，該傳感器的檢出限低至3.63 fmol/L。同樣地，GONG等[10]制備了聚苯胺/石墨烯(PAN/GN)納米復(fù)合材料，用于HIV-1基因片段，聚苯胺的存在增強(qiáng)了石墨烯溶劑中的分散性、電導(dǎo)率以及修飾電極的穩(wěn)定性，其檢出限低至0.1 fmol/L。此外，氧化石墨烯(GO)也具有特殊的光學(xué)、電化學(xué)等性能。HU等[11]以未修飾GO為固定化平臺(tái)，對HIV-1基因片段進(jìn)行電化學(xué)檢測，該傳感器的檢出限為0.11 pmol/L。證明了DNA可以成功地固定在氧化石墨烯上，但要達(dá)到較低的檢出限，還需要對氧化石墨烯底物進(jìn)行修飾。為了提高傳感器的靈敏度，研究人員開始研發(fā)納米材料修飾的GO納米復(fù)合材料。如WANG等[12]研制了一種新型電化學(xué)DNA傳感器，他們通過π-π共軛將氧化石墨烯與四苯基卟啉結(jié)合以提高RGO的導(dǎo)電性能，檢出限為60 fmol/L。石墨烯優(yōu)良的導(dǎo)電導(dǎo)熱性和超高的比表面積揭示了這種納米材料作為生物傳感器的潛在應(yīng)用價(jià)值，為研發(fā)DNA生物傳感器提供了很好的候選材料。

圖1 石墨烯生物傳感器對β-乳球蛋白的檢測示意圖Fig.1 β-lactoglobulin detection scheme based on graphene biosensor

2.2 基于碳納米管的生物傳感器

碳納米管是由sp2碳單元構(gòu)成的具有六方蜂窩晶格的納米材料[13]，在能量轉(zhuǎn)換器中，碳納米管可作為DNA探針的載體以促進(jìn)電活性物種與電極之間的電子轉(zhuǎn)移[14]，因此，碳納米管被廣泛應(yīng)用于電極的修飾以構(gòu)建電化學(xué)傳感平臺(tái)。在電極襯底上直接液滴沉積是碳納米管修飾傳感器最常用的一種方法。如WANG等[15]使用碳納米管修飾的玻碳電極用于BRCA1基因的檢測，成功實(shí)現(xiàn)了鳥嘌呤氧化信號的增強(qiáng)，該傳感器的下限為100 fmol/L。該方法十分簡單快捷，但它與表面活性劑的結(jié)合往往會(huì)引入雜質(zhì)。若將碳納米管功能化替代表面活性劑的加入則可以完美地解決這一缺點(diǎn)并提高了生物相容性和為生物分子的共價(jià)結(jié)合提供更多位點(diǎn)[16]。如YANG等[17]報(bào)道了一種用于構(gòu)建DNA生物傳感器的氧化銅納米線修飾的羧基功能化單壁碳納米管復(fù)合材料。他們使用熱氧化法制備了氧化銅納米線，并將氧化銅納米線的懸浮液與羧基功能化單壁碳納米管以1∶1體積混合滴于電極上，再將羧基激活與ssDNA之間形成共價(jià)酰鍵。該傳感器的檢出限為3.5 fmol/L。LIU等[18]則利用水熱法制備了一種基于二硫化鎢修飾多壁碳納米管復(fù)合材料，他們將2.0 mg的WS2-MWCNTs復(fù)合材料分散到1.0 mL水中，再將6 μL懸浮液滴于電極上，最后使用電化學(xué)還原法在氯金酸中得到了金納米粒子/碳納米管/二硫化鎢/玻碳電極，該傳感器可用于超靈敏測定乙型肝炎病毒基因組DNA，檢出限為2.5 fmol/L。

2.3 基于場效應(yīng)晶體管的生物傳感器

場效應(yīng)管生物傳感器主要由感受器和場效應(yīng)晶體管兩部分構(gòu)成，感受器是固定著具有分子識別功能的生物物質(zhì)的敏感膜，而場效應(yīng)晶體管(Field-effect Transistor, FET)簡稱場效應(yīng)管，是利用電場來調(diào)節(jié)輸出電流大小的半導(dǎo)體零件，起信號轉(zhuǎn)換的作用。場效應(yīng)管理論最早是由EDGAR[19]于1930年提出，大約在1950年才由SHOCKLEY[20]研制出場效應(yīng)管。此后，BERGVELD[21]又發(fā)現(xiàn)了離子敏場效晶體管(ISFET)，并用于檢測改性的青霉素酶，如今研究使用的場效應(yīng)管基本上為ISFET。JANATA和MOSS[22]將離子敏場效晶體管做了如下分類：酶場效應(yīng)晶體管、DNA場效應(yīng)晶體管和免疫場效應(yīng)晶體管，分別用于固定化酶和DNA鏈中。其中DNA場效應(yīng)晶體管的出現(xiàn)無疑是令人振奮的，其對分子生物學(xué)的研究、基因疾病的診斷和環(huán)境檢測等具有重要的意義。

2.3.1 基于石墨烯的場效應(yīng)晶體管

2013年，LI等[23]使用化學(xué)氣相沉積法在25 mm銅箔上大面積制作了厘米級別的石墨烯薄膜，通過Cu的溶解將石墨烯從銅箔中分離并轉(zhuǎn)移至硅基片以制備石墨烯場效應(yīng)晶體管，其在檢測DNA雜交時(shí)表現(xiàn)出低至1 pm的高靈敏度。但依賴于金屬襯底(如鎳膜或銅箔)的石墨烯制備方法，在轉(zhuǎn)移過程中往往會(huì)造成樣品的污染、起皺和破損，從而影響傳感器的性能，因此YUE等[24]在藍(lán)寶石襯底上制備了可直接用于傳感器的高質(zhì)量石墨烯。該方法不需要金屬催化劑或復(fù)雜的后生長轉(zhuǎn)移，與目前的場效應(yīng)管制造技術(shù)相兼容，為基于石墨烯場效應(yīng)晶體管的生物傳感器提供了廣闊前景。

除了石墨烯制備方法的改進(jìn)外，科研人員還通過在石墨烯表面進(jìn)行功能性修飾以提高傳感器性能。如CAI等[25]用共價(jià)鍵合的方法在石墨烯表面固定肽核酸(PNA)探針，采用PNA代替DNA作為捕獲探針，該傳感器具有更高的靈敏度且可重復(fù)使用，檢出限為100 fmol/L。在此基礎(chǔ)上，CAI等[26]采用金納米粒子(AuNPs)修飾石墨烯場效應(yīng)晶體管制備了DNA生物傳感器。他們將還原的氧化石墨烯(R-GO)懸浮液滴入傳感器表面，然后將AuNPs修飾到表面，而后又將PNA固定在AuNPs表面，實(shí)現(xiàn)了10 fmol/L的低檢出限。這種方法也被應(yīng)用于血清樣品中miRNA的檢測，成為了診斷基因相關(guān)疾病的潛在方法。

2.3.2 其他場效應(yīng)晶體管

除了石墨烯外，科研人員還制備了更高靈敏度的基于其他納米材料的場效應(yīng)晶體管DNA生物傳感器。如LI等[27]報(bào)道了一種基于二硫化鉬(MoS2)的場效應(yīng)晶體管生物傳感器，他們首先對傳感通道進(jìn)行正電荷修飾，然后將帶負(fù)電荷的二硫化鉬納米片滴入通道，二硫化鉬通過靜電相互作用與傳感表面緊密結(jié)合。同時(shí)，將DNA類似物磷酰二胺酸嗎啉寡核苷酸(PMO)固定在二硫化鉬表面，并通過制備的PMO-DNA雜交進(jìn)行樣品檢測。由于PMO的中性特性和高親和力，該傳感器的檢出限低至6 fmol/L。SHARIATI[28]利用銦錫氧化物納米線(ITO NWS)的強(qiáng)化電導(dǎo)和修飾表面功能，研制了一種基于銦錫氧化物納米線的DNA生物傳感器用于檢測乙型肝炎病毒(HBV)。他們將單鏈乙型肝炎病毒的DNA(SS-DNA)固定在改性納米線上作為探針，在1 fmol/L到10 μmol/L的線性濃度范圍內(nèi)測量DNA靶標(biāo)，得出DNA生物傳感器的檢測限約為1 fmol/L。該結(jié)果對開發(fā)低成本、無標(biāo)簽、靈敏的ITONWS FET生物傳感器具有良好的應(yīng)用前景和可靠性。

3 結(jié)語與展望

近年來，DNA傳感器的發(fā)展在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，開發(fā)合適的傳感材料對電化學(xué)DNA傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用，材料的開發(fā)離不開材料的功能性修飾，而修飾的方法應(yīng)該廉價(jià)且具有準(zhǔn)確重復(fù)性。在本文中，我們介紹了多種適用于構(gòu)建DNA傳感器的納米材料，并對納米材料的功能化修飾方法及其應(yīng)用的最新進(jìn)展進(jìn)行了展述。

目前，基于新型納米材料的生物傳感器仍面臨以下挑戰(zhàn)：1)納米結(jié)構(gòu)在電化學(xué)測量過程中的穩(wěn)定性有待深入研究；2)大多數(shù)基于納米結(jié)構(gòu)的傳感器是使用液滴沉積法制備的，納米結(jié)構(gòu)在電極表面的結(jié)合穩(wěn)定性需要進(jìn)一步完善；3)目前傳感器較大型化，未來應(yīng)將傳感器陣列集成于小型化系統(tǒng)中，用于實(shí)際應(yīng)用；4)最近的傳感器幾乎都是利用DNA序列的錯(cuò)配識別能力進(jìn)行DNA的檢測，未來可開發(fā)從互補(bǔ)序列和不匹配的混合序列中檢測目標(biāo)序列的傳感器。