一種混合模式反相/陰離子交換色譜固定相的制備與評價

劉會娟，楊丙成

(華東理工大學 藥學院，上海 200237)

反相液相色譜(reversed phase liquid chromato-graphy, RPLC)是發(fā)展最早、應用最廣泛的色譜技術之一，主要應用于非極性和弱極性樣品的分離[1-2]。自從1970年KIRKLAND等[3]首次制備出反相模式固定相以來，反相模式固定相已經成為應用最廣泛的液相色譜分離模式，其固定相研究也不斷有新的突破。反相模式固定相多以硅膠或改性硅膠為基質，在其表面鍵合疏水性功能基團來實現(xiàn)對疏水樣品的保留。典型反相模式固定相仍存在如下不足：1) 非特異性吸附。硅膠表面存在豐富的硅羥基，表面鍵合反應僅能利用一部分硅羥基，殘余的游離硅羥基易發(fā)生電離而呈現(xiàn)負電荷，當流動相pH ≥4時，帶負電荷的硅羥基易于吸附解離的堿性樣品(二者存在靜電作用)，從而造成堿性樣品的柱效降低、峰拖尾、分離度降低等不利影響[4]。解決此缺陷的主要措施是利用封尾技術盡量減少殘留硅羥基的數(shù)量[5]；2) 不能承受較高比例的水相。烷基在純水或高比例水相中會出現(xiàn)碳鏈纏繞而造成固定相分離能力的缺失。目前已有對傳統(tǒng)硅膠進行改性[6-7]，內嵌極性基團屏蔽樣品與硅羥基的接觸[8-12]等方案。

在藥物研究領域，堿性藥物的比例高達75%，目前分離分析堿性化合物最常用的手段仍然是RPLC，而RPLC固定相中硅膠基質又占據(jù)主要地位。盡管隨著技術的發(fā)展進步，逐漸發(fā)展出高純度的雜化硅膠，但是殘余硅羥基帶來的次級效應依然是導致堿性化合物分析中出現(xiàn)峰形拖尾、載樣量低、死吸附等難題的主要原因。因此尋求可以有效屏蔽硅羥基影響、提高耐水能力的解決方案一直是色譜固定相的研究重點。

采用同時鍵合含環(huán)氧基團的硅烷化試劑和十八烷基硅烷混合試劑，再利用小分子叔胺對環(huán)氧基進行開環(huán)，制備出表面含有季胺基的混合模式固定相?？疾祀姾善帘涡獙A性樣品拖尾的效果，并對其進行了表征、機理考察和分離應用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：RCT安全可控磁力攪拌器購于IKA儀器設備有限公司(德國)；QL-861型震蕩混合器(海門，中國)；SB-5200 DTDN型超聲清洗器購于新芝生物有限公司(寧波，中國)；電熱鼓風干燥箱購于一恒科學儀器有限公司(上海，中國)；色譜柱裝柱機購于思譜精工(大連，中國)；FE20型pH計購自梅特勒-托利多儀器有限公司(上海，中國)；Malvern Zetasizer電位儀(型號Nano ZS90)；實驗用水來自Milli-Q純水系統(tǒng)。

試劑：球形硅膠(5 μm, 10 nm, 300 m2/g)購于華譜科技有限公司(浙江，中國)；HPLC級乙腈、甲醇購自Tedia(USA)；甲酸銨、甲酸購自Acros(USA)；十八烷基三甲氧基硅烷(Octadecyltrimethoxysilane,ODS)購于百靈威(北京，中國)；3-縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTES)購于阿拉丁(上海，中國)；N,N-二甲基甲酰胺、分析純甲苯、三甲胺(trimethylamine, TMA)均購自凌峰化學試劑公司(上海，中國)；多環(huán)芳烴、小分子堿、核苷堿基、有機酸、藥品等分析物購自Sigma。

1.2 固定相的制備

固定相的制備路線如圖1所示，具體操作如下：

1) 硅膠活化：稱取3 g硅膠，超聲分散在100 mL 3 mol/L HCl水溶液中。105 ℃下回流加熱6 h，磁力攪拌(250 r/min)?；罨Y束后冷卻至室溫，用4#砂芯漏斗抽濾，去離子水洗滌數(shù)次至濾液呈中性，60 ℃過夜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2) Sil-ODS/GPTES的制備：以甲苯(30 mL)作為反應溶劑，在100 mL圓底燒瓶中加入已活化硅膠3 g，9.43 mL ODS(20 mmol)，0.46 mL GPTES(2 mmol)，在氮氣氛圍下，110 ℃，250 r/min，加熱回流反應24 h。反應結束后用4#砂芯漏斗抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇洗滌數(shù)次，60 ℃過夜烘干待用。

3) 環(huán)氧開環(huán)反應：以N,N-二甲基甲酰胺(30 mL)作為反應溶劑，在100 mL圓底燒瓶中加入3 g Sil-ODS/GPTES，0.86 mL三甲胺(4 mmol)，60 ℃，250 r/min，加熱反應1 h。反應結束后用4#砂芯漏斗抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇洗滌數(shù)次，60 ℃烘干。

圖1 固定相合成路線Fig.1 Synthesis route of the stationary phase

1.3 色譜柱裝填、液相色譜系統(tǒng)

采用高壓勻漿法裝填色譜柱，具體操作如下：稱取2.0 g固定相溶解于20 mL甲醇，超聲30秒充分混合后迅速倒入勻漿罐內，接上不銹鋼柱管(150 mm length×4.6 mm i.d.)后，以甲醇作為頂替液，34.475 MPa (5 000 psi)恒壓裝柱30 min，裝柱結束后泄壓30 min。填充結束的色譜柱以甲醇為流動相，在0.2 mL/min的流速下沖洗過夜。

色譜評價系統(tǒng)：Acchrom S3000高效液相色譜儀(華譜，中國)。

2 結果與討論

2.1 固定相的結構表征

硅膠和所得固定相的元素分析結果如表1所示。根據(jù)所得固定相(C18/TMA)的N含量，其表觀交換容量為93mol/g，表明TMA成功鍵合于硅膠表面；對比裸硅膠與C18/TMA的紅外譜圖(如圖2左)，C18/TMA固定相在2 860和2 930 cm-1的吸收峰可對應于烷基的伸縮振動峰；為驗證固定相表面季胺基團的存在，對其進行了表面電勢(ζ電位)測定(如圖2右)。裸硅膠在pH 2～7的范圍內均呈負電勢，而C18/TMA在此pH范圍內電位值均呈正電勢，即證明了季胺基團的存在。

表1 固定相元素分析結果

圖2 裸硅膠和C18/TMA的紅外光譜分析(左)和ζ電位分析(右)Fig.2 Characterization of FT-IR and ζ measurment of bare silica and C18/TMA stationary phase

2.2 反相模式分離

C18/TMA固定相鍵合了十八烷基疏水長鏈，可以提供疏水作用位點，用來分離多種非極性樣品。選擇甲苯、丙苯、丁苯、戊苯、2-甲基萘、菲、苯并菲等七種非極性物質作為目標樣品，分離效果如圖3(a)所示。七種樣品均實現(xiàn)了基線分離，其中戊苯的理論塔板數(shù)為61 346塊/m，出峰順序與分析物的非極性大小順序一致，符合疏水作用保留特點。

傳統(tǒng)C18固定相分離小分子堿，通常需要在流動相中加入緩沖鹽來減弱堿性樣品與硅羥基的靜電作用，但緩沖鹽的加入不利于色譜柱和儀器的使用壽命，尤其是當和質譜聯(lián)用時尤為明顯。為了考察C18/TMA固定相中季胺基對硅羥基的屏蔽作用，選擇二羥丙茶堿、茶堿、3-硝基苯胺、2-硝基苯胺四種小分子堿作為分析物，嘗試在流動相中不添加緩沖鹽的情況下，考察小分子堿的分離情況。實驗結果如圖3(b)所示，四種物質達到基線分離，峰形對稱性良好，不對稱因子在1.2左右，證明了季胺基團的靜電屏蔽作用可以在一定程度上屏蔽硅羥基，色譜峰拖尾現(xiàn)象得到明顯改善。

2.3 親水作用模式分離

C18/TMA含有季胺基團，可以提供離子交換位點，理論上可應用于陰離子及可解離的極性樣品的分離。而芳香酸類物質含有苯環(huán)非極性基團，為考察兩種鍵合基團對芳香酸保留的影響，選擇5種芳香酸進行分離，結果如圖4(a)所示。5種有機酸可達到基線分離，分離度在2.3以上，其中3,5-二硝基苯甲酸的理論塔板數(shù)達到73 359塊/m。流動相中緩沖鹽的pH為6.01，5種芳香酸的pKa均低于該pH，在此流動相條件下均處于解離狀態(tài)，多以離子形式存在，與固定相上的季胺基團存在離子交換作用。為考察固定相在親水模式下對強極性樣品的保留情況，選擇5種核苷堿基作為目標物進行實驗，保留效果如圖4(b)所示，在等度洗脫模式下，5種樣品在10 min內達到基線分離，以胞嘧啶的色譜峰進行計算得到理論塔板數(shù)為54 560塊/m，說明鍵合的季胺基團可以提供極性作用位點，可用于親水模式下分離極性樣品，且具有較高柱效。

2.4 色譜保留機理考察

在反相色譜模式下，水是弱洗脫溶劑，水含量對非極性物質的保留行為影響較大。以多環(huán)芳烴為分析物，通過改變流動相中的水含量考察了所得固定相的保留機理(結果如圖5所示)。在水含量比例范圍為20%～40%，隨著流動相中水含量的增加，所有樣品的保留均增加，符合典型疏水保留機理。

2.5 去濕現(xiàn)象考察

正如前文提到的，反相模式固定相在有機相比例過低，甚至是100%水相時，功能性的碳鏈會出現(xiàn)嚴重的“相塌陷”，又被稱為固定相“去濕”[13]。具體評價方法是：使用純水流動相時，在停止流速一段時間，再次恢復后樣品保留會損失，即樣品的保留時間不可重現(xiàn)。本文所得固定相結構中內嵌有羥基、醚鍵、季胺基等極性基團，理論上固定相的親水性相較于純烷基C18固定相有明顯的增強。為驗證其去濕性能，采用Stop-flow進行測試，具體操作如下：先用甲醇對色譜柱進行50倍柱體積的沖洗，接著用50 mmol/L的NH4FA沖洗50倍柱體積，待純水完全替代甲醇后，平衡進樣進行數(shù)據(jù)采集，采集結束后，流速降為0，色譜柱在此水環(huán)境下浸泡30 min，30 min后進入下一輪平衡，重復之前的操作并進樣采集數(shù)據(jù)，測試結果如圖6所示，兩種分析物的保留時間在兩次采集中無明顯變化，表明該固定相具有較好的去濕性能。

條件: 流動相，(a) MeOH/H2O: 70/30(體積比)；(b) MeOH/H2O: 60/40(體積比)；紫外檢測波長，254 nm；柱溫，30 ℃；流速，1 mL/min；進樣量，20 μL；分析物，1，甲苯；2，丙苯；3，2-甲基萘；4，丁苯；5，菲；6，戊苯；7，苯并菲；8，二羥丙茶堿；9，茶堿；10，3-硝基苯胺；11，2-硝基苯胺圖3 非極性物質(a)與小分子堿(b)的分離Fig.3 Separation of non-polar analytes (a) and organic base (b) by C18/TMA

條件: 流動相,(a)MeOH/NH4FA (20 mmol/L, pH 6.01): 95/5(體積比);(b)ACN/NH4FA (100 mmol/L, pH 6.31): 95/5(體積比)；分析物: 1, 3,5-二羥基苯甲酸; 2, 對甲苯甲酸; 3, 肉桂酸; 4, 3,5-二硝基苯甲酸; 5, 對溴苯甲酸；6，胸腺嘧啶；7，尿苷；8，腺苷；9，腺嘌呤；10，胞嘧啶.其他色譜條件同圖3圖4 芳香酸(a)和核苷堿基(b)的分離Fig.4 Separation of organic acids (a) and nucleoside base (b) by C18/TMA

條件：流動相，MeOH/H2O(體積分數(shù)見圖)；其他色譜條件同圖3圖5 水含量對多環(huán)芳烴保留因子的影響Fig.5 Effect of water content in mobile phase on the retention of PAHs on C18/TMA column

條件: 流動相，50 mmol/L NH4FA；分析物：1, 尿嘧啶; 2, 尿苷;其他條件同圖3圖6 停流測試Fig.6 Stop-flow test

2.6 藥物分析應用

2.6.1 堿性藥物的分離

本研究所得固定相，因為季胺基的存在，形成了電荷屏蔽層，理論上可在一定程度上改善堿性藥物分析的拖尾現(xiàn)象。阿米替林是用于治療原發(fā)性失眠的抗抑郁藥物，臨床上主要用于抑郁、焦慮、精神紊亂等癥狀，分析中常用其鹽酸鹽。鹽酸阿米替林結構中含有強堿性季胺基團，會與硅膠表面發(fā)生靜電作用，導致其峰形出現(xiàn)嚴重拖尾，也導致載樣量大大減低。為驗證C18/TMA固定相上的季胺基團實現(xiàn)了對游離硅羥基的電荷屏蔽作用，以鹽酸阿米替林作為分析物，對比了自制C18反相柱、商品化C18柱和自制C18/TMA柱的柱效與拖尾因子，結果如圖7。阿米替林在C18/TMA柱上的峰形相較于其他兩根色譜柱有明顯改善，商品化色譜柱的拖尾因子(3.78)是C18/TMA(1.08)的3.5倍，且柱效只有C18/TMA的一半；C18/TMA的柱效約為Sil-C18的6倍，拖尾因子也有明顯降低(Sil-C18拖尾因子1.61)，充分證明了電荷屏蔽作用的存在。

條件: 流動相，MeOH/H2O:80/20(體積比)；檢測波長，240 nm；進樣量，5 μL；其他條件同圖3 圖7 阿米替林在C18/TMA、Sil-C18和XUnion C18色譜柱的分離對比Fig.7 Comparison of tailing of amitriptyline on C18/TMA, Sil-C18 and XUnion C18 (commercial)

2.7 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性考察

重現(xiàn)性和穩(wěn)定性是評價色譜柱性能的重要指標，選擇4-硝基苯胺、腺嘌呤、苯并菲、對溴苯甲酸作為重現(xiàn)性實驗的分析物，在同一色譜條件下，日內連續(xù)進樣6次，結果如圖8(a)所示，四種樣品的保留重現(xiàn)性好，保留時間的RSD在0.06%～0.19%范圍內；日間重現(xiàn)性結果如圖8(b)所示，日間保留時間和峰面積重現(xiàn)性如圖8(c)。四種樣品日間保留時間的RSD在0.20%～1.47%范圍內，顯示出良好的重現(xiàn)性；另外，選擇多環(huán)芳烴、小分子堿、核苷和有機酸為分析物考察了C18/TMA色譜柱的運行穩(wěn)定性。在乙腈/緩沖鹽的淋洗條件下，每隔2 h進樣，每次平行進樣3次，連續(xù)淋洗34 h(約1 000倍柱體積)，統(tǒng)計分析物的保留參數(shù)變化，結果如8(d)所示。連續(xù)運行34 h后，4種分析物的保留時間RSD在0.09%～1.49%范圍內，峰面積的RSD≤1.0%，理論塔板數(shù)的RSD≤1.52%，表現(xiàn)出良好的運行穩(wěn)定性。

條件: 流動相,ACN/H2O/NH4FA(100 mmol/L,pH 6.1)80/10/10(體積比); 分析物: 1, 4-硝基苯胺; 2, 腺嘌呤; 3, 苯并菲; 4, 對溴苯甲酸; 其他條件同圖3圖8 C18/TMA色譜柱日內重現(xiàn)性(a)、日間重現(xiàn)性(b)、保留時間和峰面積(c)、運行穩(wěn)定性(d) Fig.8 Intra-day (a), inter-day(b) reproducibility, retention time and peak area (c), and running stability(d)

3 結論

利用靜電排斥的原理，制備出表面帶正電荷的C18/TMA混合固定相，可以有效克服堿性樣品(帶正電荷)在硅膠基質固定相上的吸附。所得固定相表現(xiàn)出良好的耐水和色譜性能，可以適用于非極性與極性樣品的分離分析。