植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉品質研究

王夢曼 韋彥安 孫京新,2* 周靜萱 苗春偉

1.青島農業(yè)大學食品科學與工程學院 山東青島 266109 2.青島特種食品研究院 山東青島 266109

發(fā)酵肉制品是指在自然條件下或人工控制條件下，利用微生物或酶的發(fā)酵作用，使原料肉發(fā)生一系列生物化學變化以及物理變化，而形成具有特殊色澤、質地和風味及可以比較長時期保存的肉制品[1，2]。目前用于發(fā)酵肉制品生產的微生物有乳桿菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬、酵母菌屬和青霉菌屬。Fernández M[3](2016)等在一種經過自然發(fā)酵而成的豬肉腸中添加抗菌蛋白酶(EPg222)，討論致病菌和抗腐敗菌的一些功能。Arcila J A[4](2015)等利用木糖葡萄球菌發(fā)酵肉品，研究發(fā)現產生的硝酸鹽還原酶、蛋白酶和脂肪分解酶可以保持肉類產品的顏色。Broncano J M[5](2011)等添加蛋白酶在香腸中，增加抗氧化穩(wěn)定性。用肉糖葡萄球菌和植物乳桿菌這種蛋白酶混合發(fā)酵劑進行干香腸發(fā)酵，加速了制品中的蛋白質水解速度，讓制品的成熟期提前，制品中游離氨基酸的量也發(fā)生了明顯增加。Chen Q[6](2016)等利用戊糖片球菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌的發(fā)酵劑混合物發(fā)酵哈爾濱干腸，使風味得以改善。

在發(fā)酵肉過程中，植物乳桿菌能夠產生蛋白質酶和脂肪酶分解蛋白質和脂肪，從而形成易于人體消化吸收的游離氨基酸和脂肪酸。同時在發(fā)酵過程中形成烴、醛、酮等呈味物質來改善產品風味。阮一凡[7](2020)等利用植物乳桿菌和釀酒酵母菌發(fā)酵鴨腿，賦予產品良好風味并延長了產品貨架期。石江濤[8](2015)等利用戊糖片球菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵的鴨肉具有良好的味道和口感。當前，國內外生產的發(fā)酵肉制品大都采用生鮮肉為原料進行發(fā)酵，利用乳酸菌和葡萄球菌為主發(fā)酵劑進行純菌或者混菌發(fā)酵[9，10]。生鮮肉在發(fā)酵成熟的過程中，起主要作用的是肉中固有蛋白酶、脂肪酶，起次要作用的是微生物發(fā)酵。

發(fā)酵食品歷史悠久。西方國家早期生產傳統(tǒng)西式發(fā)酵香腸。在我國有些地區(qū)生產基于乳酸菌的肉類產品。本文以植物乳桿菌為發(fā)酵劑，首先將生鴨肉高溫滅菌，使其自身的酶失活，利用植物乳桿菌生長代謝中產生的豐富的酶對其進行酶解，此過程中微生物的發(fā)酵作用將占主導地位。

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌，山東中科嘉億生物工程有限公司；

鴨胸肉，青島市城陽區(qū)大潤發(fā)超市；

試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

質構儀TA-XT2i，英國Stable Micro System公司；

顯微激光拉曼光譜儀HR800，法國Jobin-Yvon公司；

氣相色譜(gas chromatography，GC)-質譜(mass spectrometry，MS)聯(lián)用儀7890A-5975C，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌懸液的制備

將冷凍的植物乳桿菌解凍后接入配好的肉湯培養(yǎng)基中，在MRS平板上劃線，在37℃無氧條件下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后挑取單個菌落到10mL MRS平板中培養(yǎng)，并在37℃條件下靜置24h。最后在37℃條件下以2%接種進一步培養(yǎng)12h，培養(yǎng)物以8 000r/min，4℃離心10min后，倒去上層培養(yǎng)基，用無菌生理鹽水配成109cfu/mL的菌懸液備用。

1.3.2 發(fā)酵肉樣品制備

將新鮮鴨胸肉用手術刀切下并絞成肉糜后用模具壓成肉片，每份取4片置于10cm培養(yǎng)皿中。在121℃、0.1MPa條件下滅菌15min。冷卻至室溫。將制備好的植物乳桿菌懸液無菌操作下以5%接種量接種于鴨肉中。密封在20℃恒溫條件下發(fā)酵，分別于鴨肉發(fā)酵過程中第0、3、5、7、9、12、14、17天觀察對照組和發(fā)酵鴨肉制品。

1.3.3 發(fā)酵過程中質構測定

在常溫條件下取3.0cm×3.0cm×1.0cm的樣品用TA-XT2i質構儀(英國Stable Micro Systems公司)測試發(fā)酵過程樣品，3次重復。依據Park W[11](2016)等的方法，探頭型號P/0.5 R柱，用TPA二次下壓；探頭型號P/0.5 R柱，試驗前速度為2.0mm/s，試驗速度為1.0mm/s，測試后速度5.0mm/s，下壓距離8.0mm，觸發(fā)5.0g。測定參數：彈性，硬度，黏度。

從TPA實驗特征曲線得到計算參數：硬度=第一個最高點；彈性=4～5間時間/1～2間時間；粘性=4～6和1～3之間的曲線所包圍的區(qū)域；粘著性=硬度×內聚性。

1.3.4 拉曼光譜

依據Chen H[12](2011)等的方法,將對照組和植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉樣品通過顯微激光拉曼光譜儀(JY Labram HR 800，法國Jobin-Yvon公司)測定，激光器為785nm，功率為100mw，光譜的獲得條件為開孔200μm，600g/mm光柵，進行3次掃描，積分時間為60s，分辨率為2cm-1，數據獲取速度為120cm-1/min，獲取的拉曼光譜在300～3 500cm-1。通過比較多肽和蛋白質拉曼光譜獲得氨基酸側鏈光譜條帶和肽鍵骨架振動分配[13～15]。每個樣品測試3次,測試完成后用顯微激光拉曼光譜儀中軟件Labspec對光譜進行平滑處理。蛋白質的二級結構(隨機卷曲，β-折疊，α-螺旋和β-轉角)的含量可以通過曲線擬合結合傅里葉反卷積計算得到[16]。

1.3.5 氣相色譜-質譜(GC-MS)

將對照組和植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉樣品，分別用刀具將制品弄碎成肉糜，并在4～8℃條件下發(fā)酵一段時間后，各取5g于固相微萃取瓶中。萃取頭于氣相色譜進樣口中，在280℃條件下老化60min后，提取頭插入瓶頂。在60℃條件下萃取60min，吸附結束后，取出萃取頭，再于氣相注射儀中在250℃條件下解吸2min。

GC-MS色譜條件：運用TR-5-MS毛細管色譜柱(31m×0.25mm，0.26μm)。

升溫程序：起始柱溫40℃，保持2min，以5℃/min至195℃，再以10℃/min至225℃，保留11min，運行總時間51min。

檢測溫度240℃；載氣為He；流速1.6mL/min；恒壓13.02kPa；離子源溫度240℃；電子能量70ev。

電腦跟數據庫匹配。定性結果使用一定程度的匹配和反匹配大于800。對揮發(fā)性風味成分的定量分析采用相對含量(%)按峰面積歸一化法處理。

2 結果與分析

2.1 質構

硬度是成熟程度的量度，與鴨肉蛋白質的變性、水解以及水分耗損有關[17]。從發(fā)酵開始，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉硬度比對照組(未發(fā)酵鴨肉)顯著降低(p<0.05)(圖1)。是由于植物乳桿菌繁殖生長，蛋白酶產生代謝產物蛋白酶，將樣品中的蛋白分解成為小分子的蛋白、胨以及小肽等。制品的含水量、脂肪含量和蛋白質含量會對硬度有影響[18]。李小妮[19](2020)等用不同的菌種對臘腸進行發(fā)酵，得出結論，添加植物乳桿菌可以緩解肉品的硬度。

圖1 發(fā)酵過程中鴨肉制品硬度變化Fig. 1 Hardness changes of duck meat products during fermentation

本研究中發(fā)酵鴨肉在成熟過程中，溶膠會不斷轉變?yōu)槟z，從而提高鴨肉的硬度，但同時，由于蛋白質具有降解作用，硬度會降低。發(fā)酵前7d，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉與對照組(未發(fā)酵鴨肉)彈性無顯著差別(p>0.05)；發(fā)酵7d后，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉彈性比對照組(未發(fā)酵鴨肉)顯著降低(p<0.05)(圖2)。本研究中發(fā)酵鴨肉在發(fā)酵過程中蛋白質水解程度的不斷增加，產生大量水溶性物質，導致蛋白質的網狀結構被破壞，樣品彈性出現下降趨勢。

圖2 發(fā)酵過程中鴨肉制品彈性變化Fig. 2 Elasticity changes of duck meat products during fermentation

Kargozari M[20](2014)等利用4種配方發(fā)酵香腸，得出結論中其發(fā)酵香腸彈性變化范圍與本研究中植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉相似。發(fā)酵前7d，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉與對照組(未發(fā)酵鴨肉)黏性無顯著差別(p>0.05)；發(fā)酵7d后，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉黏性比對照組(未發(fā)酵鴨肉)顯著增大(p<0.05)(圖3)。這與植物乳桿菌生長旺盛有關，發(fā)酵7d后菌絲體分泌物變多，水分含量升高，因此產品黏性增大。Laranjo M[21](2015)等通過研究干發(fā)酵香腸，得出結論黏度隨著發(fā)酵時間的進行呈上升趨勢。

圖3 發(fā)酵過程中鴨肉制品黏性變化Fig. 3 Viscosity changes of duck meat products during fermentatio

2.2 蛋白質二級結構

蛋白質的二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等不同類型。拉曼光譜圖中，酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶具有較強的拉曼效應并且極少受到其他分子群的干擾，所以在分析和鑒定蛋白質二級結構時，把酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶作為可靠依據[22]。如圖4所示，在拉曼光譜中，酰胺Ⅰ帶的范圍為1 600～1 700cm-1，其中，1 645～1 657cm-1是高α-螺旋含量的蛋白質在拉曼光譜上的條帶中心所在的區(qū)域；β-折疊結構為主的條帶位于1 665～1 680cm-1；1 680cm-1為β-轉角含量高的蛋白質的條帶所在區(qū)域；無規(guī)則卷曲結構在1 660～1 665cm-1范圍內。在酰胺Ⅲ帶的范圍中，表征不同結構的譜帶有部分重合的區(qū)域，高α-螺旋含量的蛋白質主要在1 260～1 300cm-1處，在含量范圍內，與β-轉角存在重合區(qū)域；β-折疊在1 238～1 245cm-1處；無規(guī)則卷曲結構出現在1 250cm-1處[23]。

圖4 對照組(A)與植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品(B)蛋白質拉曼光譜(500～2 500cm-1)Fig. 4 Control (A) and Lactobacillus plantarum fermentation of duck meat products (B) Protein Raman spectroscopy (500～2 500cm-1)

植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉產品中含有的蛋白質二級結構的每一種的含量，可以在圖5中看出來。在加入植物乳桿菌后，α-螺旋含量由62%顯著減少到43%(p<0.05)；β-折疊含量由18%顯著增加到32%(p<0.05)；β-轉角和無規(guī)卷曲含量增加不顯著(p>0.05)。常榮[24](2019)等發(fā)現蛋白質二級結構中的β-折疊含量會隨著氫鍵的增多而增多，而且，通過提高NaCl添加量，也會提升α-螺旋結構解折疊，形成β-折疊結構。Barrtee T W[25](1978)等通過研究，無機鹽作用于肌動蛋白，這是由于多肽鏈間氫鍵增加引起蛋白質α-螺旋含量降低。Wu Z[26](2006)等也通過研究，得出結論NaCl含量超過3%同樣會導致α-螺旋含量降低。多肽鏈間氫鍵的數量會影響β-折疊的形成，同時在肌原纖維蛋白熱作用下會形成凝膠，在此過程中會導致β-折疊含量增加[27]。

圖5 鴨肉制品蛋白質二級結構含量Fig. 5 Content of secondary structure of protein duck meat products

2.3 氣相色譜-質譜(GC-MS)

從表1看出，植物乳桿菌發(fā)酵鴨胸肉產品的揮發(fā)性風味物質的數量以及種類有所上升。植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉中檢出10種可以揮發(fā)的味道物質，其中有酮類1種，烴類3種，醛類1種，醇類2種，過氧化物1種，胺類1種；未發(fā)酵鴨胸肉產品中可以散發(fā)的味道成分有7種，有酮類1種，烴類2種，醛類1種，醇類3種。未發(fā)酵鴨胸肉主要可以散發(fā)的味道性物質有醇、酮、烷、醛。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉揮發(fā)性風味物質Table 1 Lactobacillus plantarum fermentsvolatile flavor substances in duck meat

在植物乳桿菌發(fā)酵鴨胸肉產品中，胺類和過氧化物數量顯著增加(p<0.05)；烴類物質增加不顯著(p>0.05)，醇類物質下降不顯著(p>0.05)。植物乳桿菌在發(fā)酵鴨肉時，通過鴨肉自身的酶系分解蛋白質、脂肪，生產小分子肽和脂肪酸，其為揮發(fā)性物質的前體。醛類作為中間體，能夠參與氨基酸和羰基化合物的相互作用[28]。

3 結論

植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品與對照組(未發(fā)酵鴨肉)相比在質地、蛋白質二級結構、揮發(fā)性物質種類等方面發(fā)生了品質變化。植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品的硬度和彈性明顯降低，黏性明顯增加；在蛋白質二級結構中，α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加；而且，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品的風味物質增多，尤其是醇，在數量和比例上明顯增加。因此，植物乳桿菌為發(fā)酵劑生產出的發(fā)酵鴨肉制品，有良好的風味和質地，推動了發(fā)酵鴨肉制品的發(fā)展。