加味復(fù)方三棱丸對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥血管生成及其侵襲性的影響*

葉蘭，陳怡，何正光，陳剛，徐曉玉**

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025；2.西南大學 藥學院，重慶 400715；3.重慶師范大學醫(yī)院 藥劑科，重慶 400047；4.重慶工商大學藥物研究中心，重慶 400067)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是一種女性常見疾病[1]，研究表明免疫機制和血管新生可能在EMS的發(fā)生和發(fā)展中有著重要作用[2]。血管內(nèi)皮細胞在異位組織上侵襲性生長時可以釋放細胞因子、蛋白水解酶等物質(zhì)，可增加內(nèi)膜細胞的侵襲能力，同時促進異位組織的增殖[3]。三棱丸由三棱和莪術(shù)兩味中藥組成，有調(diào)控血管新生、改善瘀血經(jīng)閉的功效[4-5]。三七具有抗炎作用[6-7]。尚未見上述主成分合用于治療EMS?；诖?，本研究分別選取三棱、莪術(shù)、三七的有效成分三棱酸、莪術(shù)油和三七總皂甙組成加味復(fù)方三棱丸(san-leng-wan，SLW)，擬從三棱丸抑制血管新生及侵襲性的角度探討其治療EMS的療效及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與主要試劑 三棱酸(廣西昌洲天然產(chǎn)物開發(fā)有限公司)、莪術(shù)油軟膠囊(浙江維康藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20054256)、水提三七總皂甙(云南紅云生物工程技術(shù)有限公司，國食健字G20040597)以及孕三烯酮膠囊(北京紫林藥業(yè)有限公司，國藥準字H19980020)，ELISA試劑盒(深圳晶美生物工程公司)、總RNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制-1(TIMP-1)抗體(Santa Cruz公司)，免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，MMP-9、TIMP-1、β-actin引物(英駿生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2動物 清潔級SD大鼠61只，均為雌性，體質(zhì)量(200±20)g，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，動物使用許可證SYXK(渝)20020007，動物生產(chǎn)合格證SCXK(渝)20020003。

1.2 方法

1.2.1制作大鼠EMS模型[8]通過陰道脫落細胞涂片判定大鼠性周期，選擇在大鼠動情期進行手術(shù)制作EMS模型。5%水合氯醛以0.07 mL/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒鋪巾，切開下腹部暴露子宮，分離右側(cè)子宮后切除約1 cm長的子宮段，剪成約5 mm×5 mm的子宮組織(包括肌層)，選取兩塊子宮內(nèi)膜組織，以漿膜面朝向腹膜及黏膜面朝向腹腔用線固定四角于左側(cè)腹壁肌肉，然后關(guān)腹。

1.2.2模型大鼠異位組織檢測[8]手術(shù)后第4周切開造模大鼠下腹部觀察，異位移植物體積增大伴有液體積聚，可見異位組織有隆起透亮的小囊狀結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋，并有血管形成，測量異位組織的體積，切取移植物送檢，證實移植物中有子宮內(nèi)膜上皮細胞、腺體及間質(zhì)的生長。將符合上述觀察結(jié)果，且異位組織體積≥8 mm3的動物作為子宮EMS大鼠模型，納入后續(xù)實驗。

1.2.3分組處理 選取EMS模型大鼠40只隨機均分為5組，包括模型組、孕三烯酮組[0.5mg/(kg·d)]、SLW(高、中、低)劑量組 [分別為最佳劑量的3、1、1/3倍，最佳劑量在課題組前期經(jīng)過正交試驗確定為0.50 g/(kg·d)三棱酸+1.00 g/(kg·d)莪術(shù)油+0.02 g/(kg·d)三七總皂甙]，另取8只正常大鼠作為正常組。SLW各劑量組和孕三烯酮組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥28 d。正常組及模型組每天以等容積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃28 d。

1.3 觀察指標

1.3.1腹腔液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量 造模、灌胃28 d后，禁食12 h，抽取各組大鼠腹腔液1 mL，離心1 000 r/min，10 min后取上清液。按照試劑盒說明書，ELISA檢測腹腔液中VEGF含量。設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL；待測樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.3.2血清雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)含量的測定 頸動脈放血法處死各組大鼠后，取血清1 mL，采用放免法檢測E2和P含量。

1.3.3取組織標本 造模、灌胃28 d后，取模型組、孕三烯酮組及SLW(高、中、低)劑量組大鼠造模部位異位組織，采用游標卡尺測量異位組織體積大小后分成兩部分，一部分異位組織(50 mg)放入液氮凍存待用；另一部分異位組織置于多聚甲醛固定液固定24 h，常規(guī)包埋后連續(xù)切片，后行HE染色、免疫組化。正常組取子宮采用液氮凍存或甲醛固定，其余方法同前。

1.3.4MMP-9、TIMP-1、Ⅷ因子的表達 選取各組大鼠內(nèi)膜組織空白切片，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替Ⅰ抗作為陰性對照，抗Ⅷ因子(微血管標志物)、抗MMP-9以及抗TIMP-1 抗體作為Ⅰ抗，進行免疫組化染色，鏡下觀察各組切片的染色結(jié)果，圖像分析系統(tǒng)進行分析。MMP-9與TIMP-1陽性判定標準[9]：陽性為組織腺上皮及間質(zhì)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，不出現(xiàn)者為陰性。鏡下觀察結(jié)果根據(jù)棕色反應(yīng)的陽性程度及面積判斷，陽性程度分為無著色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)以及棕褐色(3分)，陽性面積分為無著色為0分、著色<1/3為1分、1/3～2/3為2分以及>2/3為3分。

1.3.5微血管密度(MVD)的判定[10]Ⅷ因子是微血管標志物，其免疫組化染色結(jié)果是用于MVD的判定。在低倍鏡(100×)下找出各組子宮異味內(nèi)膜組織中微血管最密集的部位后，在高倍鏡(200×)下進行觀察。采用Hawighorst 等[11]的判斷標準，結(jié)果以3個200倍視野下血管數(shù)目的平均數(shù)來表示，以在內(nèi)膜組織中與鄰近微血管、腺體組織分界清楚的任何一個染成棕色的細胞或細胞叢均被認為是1個新生血管。

1.3.6子宮異位組織中MMP-9、TIMP-1mRNA的表達[12]采用RT-PCR法，TIMP-1引物序列上游5′-atctggcatcctcttgttgc-3′，下游5′-aagaagctgcaggcattgat-3′，擴增產(chǎn)物為354 bp；β-actin引物序列上游5′-agccatgtacgtagccatcc-3′，下游5′-tctcagctgtggtggtgaag-3′，擴增產(chǎn)物為227 bp；MMP-9引物序列上游5′-cgtcgtgatccccacttact-3′，下游5′-agagtactgcttgcccagga-3′，擴增產(chǎn)物為433 bp。按說明書提示條件，94 ℃預(yù)變性2 min，變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共持續(xù)40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)下成像，光密度掃描。目的擴增條帶的光密度值與對照組β-actin的光密度值之比作為分析值。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 模型復(fù)制結(jié)果

術(shù)后4周，異位組織外觀呈隆起透亮的小包狀，表面有血管生成，內(nèi)部充滿積液(圖1)。53只大鼠中40只建模成功，成功率為75.5%(40/53)，模型大鼠均未死亡，成活率100%。

圖1 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位組織外觀Fig.1 The ectopic tissues of EMS models

2.2 各組EMS大鼠異位組織體積

與模型組比較，SLW不同劑量組大鼠異位組織體積減小，SLW高、中劑量組體積減小最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位組織的體積Tab.1 Effect of SLW on the heterotopic tissue volume size of EMS

2.3 正常組大鼠子宮內(nèi)膜和其他組大鼠異位內(nèi)膜的組織學觀察

正常組大鼠，子宮內(nèi)膜由內(nèi)向外分別為上皮細胞層、間質(zhì)細胞層及少量纖維結(jié)締組織，囊內(nèi)為少量漂浮的白細胞和黏液。模型組大鼠，異位內(nèi)膜腺上皮細胞呈高柱狀或矮柱狀排列在囊泡內(nèi)腔面，細胞核大呈橢圓形位于基底部，細胞內(nèi)胞漿豐富；腺上皮細胞內(nèi)膜間質(zhì)豐富，可見個別部位有腺上皮層內(nèi)陷形成假腺體，完整腺腔中可見分泌物存在，分泌物呈淡紅色。孕三烯酮組和SLW高劑量組內(nèi)膜腺上皮層可見明顯變薄，腺上皮細胞呈矮柱狀、排列松散、細胞核不規(guī)則，腺上皮胞漿嗜堿性增加。見圖2。

圖2 正常組大鼠子宮內(nèi)膜和其他組大鼠異位內(nèi)膜的組織學觀察(HE，×40)Fig.2 Histopathological changes of endometrium in each group(HE，×40)

2.4 各組大鼠腹腔液VEGF的含量

與正常組比較，模型組大鼠VEGF增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，SLW高、中劑量組腹腔VEGF含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腹腔液VEGF的含量Tab.2 Effect of SLW on the contents of VEGF in peritoneal fluid of EMS

2.5 各組大鼠血清E2、P水平

與正常組比較，模型組大鼠血清E2含量升高(P<0.05)；與模型組比較，SLW高、中、低劑量組大鼠血清E2含量降低(P<0.01或P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清E2、P水平Tab.3 Effect of SLW on the E2 and P concentration of serum in EMS

2.6 不同劑量SLW對EMS異位組織MMP-9、TIMP-1表達的影響

正常組子宮內(nèi)膜組織MMP-9陽性染色細胞數(shù)量少，染色淺；模型組異位組織MMP-9陽性染色細胞數(shù)量多，染色呈明顯黃色或棕黃色，其表達評分分值較正常組增高(P<0.05)；而SLW高、中、低劑量組MMP-9陽性細胞數(shù)量減少、染色淺，其表達評分分值較模型組降低(P<0.05)；見圖3。正常組子宮內(nèi)膜組織TIMP-1陽性染色細胞數(shù)量多，染色深；模型組異位組織TIMP-1陽性染色細胞數(shù)量少，胞漿染色呈淡黃色，其表達評分分值較正常組降低(P<0.05)；而SLW各劑量組異位組織中TIMP-1陽性細胞數(shù)量多且深染，其表達評分分值較模型組增高(P<0.05)；見圖4。

圖3 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織和其他組大鼠異位組織中MMP-9蛋白的表達(DAB，×20)Fig.3 Immunohistochemical staining of MMP-9 expression in endometrium(DAB，×20)

圖4 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織和其他組大鼠異位組織中TIMP-1蛋白的表達(DAB，×20)Fig.4 Immunohistochemical staining of TIMP-1 expression in endometrium(DAB，×20)

2.7 不同劑量SLW對EMS大鼠子宮異位組織MVD的影響

與正常組比較，模型組大鼠子宮異位組織MVD增加(P<0.05)，提示模型組異位組織內(nèi)血管較正常組子宮更密集。與模型組比較，SLW高、中劑量組大鼠子宮異位組織MVD減少(P<0.05)，提示SLW高、中劑量組大鼠血管數(shù)較模型組減少(P<0.05)。見表4、圖5。

圖5 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織和其他組大鼠異位組織中Ⅷ因子的表達(DAB，×20)Fig.5 Immunohistochemical staining of factor VIII expression in endometrium(DAB，×20)

表4 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織和其他組大鼠異位組織中MVD水平Tab.4 Effects of SLW on the MVD in the heterotopic tissues of EMS

2.8 不同劑量SLW對EMS大鼠異位組織MMP-9、TIMP-1 mRNA表達的影響

模型組大鼠異位內(nèi)膜組織MMP-9 mRNA的表達較正常組增加(P<0.05)，SLW各劑量組異位內(nèi)膜組織MMP-9 mRNA的表達較模型組減少(P<0.05)；模型組大鼠異位內(nèi)膜組織TIMP-1 mRNA的表達較正常組減少(P<0.05)，SLW各劑量組異位內(nèi)膜組織TIMP-1 mRNA的表達較模型組增加(P<0.05)。見表5、圖6。

表5 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織和其他組大鼠異位組織中MMP-9、TIMP-1mRNA的表達Tab.5 Effect of SLW on expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in the heterotopic tissues of EMS rats

MMP-9 mRNA TIMP-1mRNA 圖6 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織和其他組大鼠異位組織中MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(RT-PCR)Fig.6 Effect on the expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in ectopic tissues of EMS rats(RT-PCR)

3 討論

EMS是育齡婦女常見的疾病，其主要病理生理過程為子宮內(nèi)膜碎片于經(jīng)期隨經(jīng)血逆流，通過輸卵管種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜，隨后在種植處繼續(xù)生長和蔓延，導(dǎo)致EMS形成[13]。藥物治療一般是抑制EMS形成，多推薦長期的、可負擔且副作用較小的治療方案[14-16]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三棱莪術(shù)含藥血清可以抑制VEGF蛋白和mRNA的表達，從而抑制新生血管生成[17]；三棱莪術(shù)水提液可抑制新生肉芽組織中新生血管生成，進一步證實三棱莪術(shù)可抑制VEGF蛋白和mRNA在新生血管的表達[18]。基于前期研究，本研究觀察了SLW對大鼠EMS發(fā)展、血清激素水平的調(diào)節(jié)、血管生成的影響，以及異位內(nèi)膜侵襲周圍組織能力的影響。結(jié)果顯示SLW中、高劑量組可以有效減小異位內(nèi)膜的體積，降低血清E2水平、MMP-9蛋白和mRNA的表達以及VEGF含量，SLW的3個劑量組均可升高TIMP-1蛋白及mRNA的表達。

研究顯示新生血管生成過程中，內(nèi)皮細胞循環(huán)和血管結(jié)構(gòu)形成均需要細胞外基質(zhì)的降解和重建，MMP在其中起重要作用[19-20]。MMP家族中MMP-9屬于IV型膠原，相對分子質(zhì)量為92 000，表達在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、巨噬細胞、基質(zhì)細胞等細胞中。MMP-9能降解如IV型和V型膠原蛋白、纖維結(jié)合蛋白等細胞外基質(zhì)(ECM)成分[21-22]。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組異位內(nèi)膜MMP-9蛋白與mRNA表達量升高，經(jīng)SLW治療4周后異位內(nèi)膜體積明顯縮小，病理學改變明顯，血清E2含量降低，腹腔液VEGF含量降低，異位內(nèi)膜MVD減少，MMP-9蛋白與mRNA表達降低，提示SLW的作用機制與削弱MMP對ECM的降解作用密切相關(guān)。

TIMP是MMP的天然抑制物。有研究顯示TIMP可阻礙MMP介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞侵襲，并抑制基質(zhì)中促血管生長因子的釋放，減少ECM的降解[23]。其中TIMP-1不僅在子宮內(nèi)膜基質(zhì)、腺體以及腔上皮中表達，而且在血管內(nèi)皮細胞中也有表達。TIMP-1可結(jié)合活化的MMP-9形成復(fù)合體從而抑制其活性。有研究顯示TIMP-1能抑制血管內(nèi)皮細胞出芽[24-25]。本實驗中發(fā)現(xiàn)模型組異位內(nèi)膜TIMP-1蛋白與mRNA表達量減少，而經(jīng)治療4周后，TIMP-1蛋白與mRNA表達升高，提示SLW的作用機制與增強TIMP后進一步抑制MMP介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞侵襲，降低ECM的降解有關(guān)，從而延緩EMS疾病的進程。

綜上所述，SLW可抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展，其機制可能與其抑制EMS大鼠腹腔微環(huán)境VEGF分泌，抑制異位組織血管新生及其侵襲能力相關(guān)。這將為SLW的進一步臨床應(yīng)用開發(fā)提供實驗依據(jù)和新思路。