高濃度葡萄糖對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

張童桐，司莉南，許紅霞，程文秀，陶瑞鑫，李娟

(南京農業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

質量優(yōu)良的卵母細胞是體外受精(IVF)、體細胞核移植(SCNT)以及胞漿內單精子顯微注射(ICSI)等生物技術的前提[1]。影響豬卵母細胞成熟的因素有很多，比如體外成熟環(huán)境、體外成熟液成分、卵母細胞與卵丘細胞間的互作及自身的新陳代謝。哺乳動物進入發(fā)情周期后，卵母細胞恢復減數分裂并在排卵前經過促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)等激素協同作用完成成熟過程[2]。卵母細胞成熟包括細胞核和細胞質成熟，只有細胞核和細胞質都成熟的卵母細胞才具備受精和胚胎發(fā)育的能力[3-4]。細胞核成熟是卵母細胞從第一次減數分裂前期的雙線期的停滯狀態(tài)恢復并完成第一次減數分裂，排出第一極體的過程。細胞質成熟則是卵母細胞完成mRNA和蛋白質的積累，細胞骨架和細胞器的重組以及細胞代謝的改變，為卵母細胞以后的發(fā)育奠定基礎[5-6]。

卵母細胞的外部環(huán)境對卵母細胞的成熟及隨后的胚胎發(fā)育都會產生影響[7]。其中能量代謝對于卵母細胞的成熟是至關重要的，而葡萄糖是卵母細胞的關鍵代謝產物。因此葡萄糖濃度對卵母細胞成熟，減數分裂的恢復，卵丘細胞的成熟，細胞核和細胞質成熟都十分重要[7]。葡萄糖代謝異常會導致卵母細胞成熟和發(fā)育能力降低[7]。在卵母細胞成熟期間，卵泡液中的葡萄糖濃度與血漿中葡萄糖濃度水平相當[8-9]，并且葡萄糖濃度與卵巢卵泡大小存在一定正相關[10]。與代謝物不斷輸入的卵泡環(huán)境相比，靜態(tài)體外成熟(IVM)系統(tǒng)要求培養(yǎng)基含有一定超生理濃度的葡萄糖，以避免消耗至對卵母細胞發(fā)育有害的水平。例如，通常用于IVM的TCM-199含有5.6 mmol/L葡萄糖。在IVM培養(yǎng)基中提供足夠濃度的葡萄糖可改善卵母細胞的核成熟和發(fā)育能力[11-12]。但是，葡萄糖濃度過低(小于2.3 mmol/L)或過高(大于10 mmol/L)對卵母細胞發(fā)育有害。針對糖尿病患者及動物模型的研究揭示，糖代謝異?？梢鹇涯讣毎顺墒飚惓?，減數分裂過早恢復[13]，且會導致胚胎發(fā)育延遲，胚胎發(fā)育潛能降低，胚胎退化和碎片化的發(fā)生率增加[14]。在低葡萄糖濃度環(huán)境中，卵母細胞糖酵解能力的擾動表現為通過磷酸戊糖途徑(PPP)和己糖糖二磷酸途徑(EMP)的葡萄糖通量下降，從而限制了核酸合成和能量產生的底物[15]。而高濃度葡萄糖的體外成熟環(huán)境會導致牛卵母細胞氧化應激，發(fā)育潛能降低[16]。

隨著人類生活水平的提高，糖尿病患者急劇增加，研究人員常用豬作為可能的異種器官移植來源。因此，探索高濃度葡萄糖對豬卵母細胞的影響，有助于對人類糖尿病的研究。雖然葡萄糖是卵母細胞成熟必需的能量來源之一[17]，但在豬卵母細胞的體外成熟過程中針對高濃度葡萄糖的研究卻較少，故本試驗將針對這一問題做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑

生理鹽水、抗生素購自南京市的藥店；TCM-199培養(yǎng)基、礦物油、牛血清蛋白(BSA)、透明質酸酶(Hya)、杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)、澳洲胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；GSH和GSSG檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自碧云天；葡萄糖購自Sigma公司。

1.2 卵母細胞采集與挑選

屠宰場母豬選擇初情期前，未配種的大白母豬。在屠宰中取下母豬內臟之后，迅速將卵巢剪下用加有硫酸慶大霉素的生理鹽水進行清洗，并防止污染產生。采集卵巢時須佩戴無菌乳膠手套，同時保持腹腔臟器干凈清潔。將采集到的卵巢置于38.5 ℃、含雙抗(青霉素、鏈霉素)200 IU/mL(如無特殊標注，雙抗均為此濃度)的0.9% NaCl生理鹽水中，用不銹鋼保溫桶(瓶口直徑約7 cm，容積大約1.2 L)無菌運回實驗室。通常在2 h以內運回為最佳時間，由于運輸距離較遠，本實驗室采用大巴車托運的方式，在3 h內運回實驗室。

卵巢無菌送達實驗室后，用預熱含雙抗的生理鹽水洗去卵巢表面血跡和雜質，放入37 ℃水浴鍋中，保溫待用。采用抽吸法對卵母細胞進行采集。注射器抽取卵泡大小為2～6 mm的卵泡液，于38.5 ℃熱臺上靜置沉淀15 min。吸除上層卵泡液，留下沉淀，加入適量洗卵液(ASP)(TCM-199中加0.8 mmol/LL-谷氨酰胺，2% FBS)稀釋沉淀，分裝于60 mm培養(yǎng)皿中。在體視顯微鏡下，挑選出質量良好的具有3層及以上卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合體(COCs)，質量好的COCs卵胞質均勻呈亮灰色，卵丘細胞分布均勻緊湊，質量差的COCs顏色發(fā)暗，卵丘細胞分布不均或幾乎沒有。

1.3 卵母細胞體外成熟

將收集得到的COCs經IVM清洗后，隨機分為3組(每組60枚)，分別移入已在CO2培養(yǎng)箱中平衡4 h以上的含有不同濃度葡萄糖的IVM中(每孔60枚)，同時覆蓋400 μL無菌石蠟油。在38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)42 h。3個組分別為空白對照組(C)：IVM(TCM-199添加10% FBS、10% 豬卵泡液、0.8 mmol/LL-谷氨酰胺、0.242% 硫酸慶大霉素、15 IU/mL 孕馬血清促性腺激素、15 IU/mL人絨毛膜促性腺激素)中加入正常濃度(5.6 mmol/L)的葡萄糖；高濃度葡萄糖組1(G-1)：IVM中加入葡萄糖濃度為10 mmol/L；高濃度葡萄糖組2(G-2)：IVM中加入葡萄糖濃度為15 mmol/L。

1.4 卵丘擴散統(tǒng)計與成熟卵母細胞挑選

培養(yǎng)42 h后，COCs平鋪于培養(yǎng)皿底部，進行拍照并統(tǒng)計。卵丘擴散標準參照文獻[18-20]，根據主觀等級從“ 0”到“ +4”評估擴展程度，具體判定標準如下：“ 0”卵丘細胞無擴展；“+1”僅分離卵丘細胞的最外層；“+2”卵丘細胞進一步擴展，涉及卵丘的外半部分；“+3”卵丘細胞進一步擴展，但不包括放射冠，“+4”卵丘細胞完全擴展，包括最里面的放射冠。分別對C組、G-1組和G-2組擴散程度較好的COCs，即“+3”、“+4”的COCs進行統(tǒng)計。之后，將COCs置于400 μL 38.5 ℃ 預熱Hya (1 mg/mL)中，移液槍經反復吹打使卵母細胞和卵丘細胞分離。挑選成功排出第一極體的、質量較好的MII期卵母細胞，并統(tǒng)計各組成熟效率。質量好的卵母細胞胞質呈亮灰色，胞質均勻，胞質與透明帶之間有一條透亮的條帶。

1.5 孤雌激活與胚胎體外培養(yǎng)

挑選的MII期卵母細胞在F+激活液(0.3 mol/L甘露醇，0.1 mmol/L MgSO4，0.05 mmol/L CaCl2，0.01%聚乙烯醇)的液滴中平衡30 s，待其沉入液滴底部。每次取5枚平衡好的卵母細胞，放入已添加F+激活液的激活槽中(BTX model 450，電極間距為0.5 cm)，單直流脈沖(0.86 kV/cm,80 μs)激活。電激活后，在孤雌激活液(PCC，胚胎體外培養(yǎng)液PZM3中添加細胞松弛素B 5 mg/mL)和放線菌酮(CX，1 mg/mL)化學激活4 h。隨后，將卵母細胞用PZM-3中清洗3次，移入已于CO2培養(yǎng)箱中平衡了4 h以上的PZM-3中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度。分別統(tǒng)計各組2-細胞、4-細胞和囊胚的發(fā)育效率。

1.6 卵母細胞線粒體、ROS熒光染色和胚胎囊胚核熒光染色

1.6.1 卵母細胞線粒體熒光染色

挑選MII期卵母細胞，用PBS液清洗3次；各組每次取15枚卵母細胞，于38.5 ℃培養(yǎng)箱中使用Mito-Tracker(10 μg/mL)活染15 min；PBS清洗3次，每次5 min；多聚甲醛(PFA)中室溫固定30 min；Hoechst 33342(10 μg/mL)室溫避光染核10 min，再次PBS1清洗3次，每次5 min；在載玻片上滴加一滴甘油，將胚胎放入，在蓋玻片四角涂抹羊毛脂，置于甘油正上方進行壓片，壓至胚胎略微扁平，制片完成后，用蔡司LSM700共聚焦顯微鏡拍照。

1.6.2 卵母細胞活性氧(ROS)熒光染色

挑選MII期卵母細胞，用PBS清洗3次；各組每次取15枚卵母細胞，置于38.5 ℃培養(yǎng)箱中，使用ROS(10 μg/mL)活染30 min；PB1清洗3次，每次5 min；然后直接在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6.3 囊胚細胞核熒光染色

于168 h收集囊胚,進行Hoechst染色。細胞核染色及觀察方法同上。

1.7 卵母細胞GSH和MDA含量測定

1.7.1 GSH含量測定

各組收集MII期卵母細胞30枚，PBS清洗后，加入10 μL蛋白試劑去除M溶液，使用液氮和37 ℃水浴鍋進行3次快速凍融，4 ℃放置或冰浴放置5 min。4 ℃高速離心機10 000g離心10 min，取上清暫放-80 ℃冷凍保存，連續(xù)收集3次樣品進行測定。按照GSH和GSSG檢測試劑盒操作說明將樣品、標準品和試劑加入96孔板，使用酶標儀在412 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算GSH含量。

1.7.2 MDA含量測定

各組收集MII期卵母細胞30枚，PBS清洗后，10 μL細胞裂解液(P0013)裂解，裂解后12 000g離心10 min，取上清暫放-80 ℃冷凍保存，連續(xù)收集3次樣品進行測定。按照MDA檢測試劑盒操作說明配制好檢測反應體系，將檢測反應體系工作液按200 μL體系加入到96孔板中，隨后使用酶標儀在532 nm測定吸光度。按照標準品吸光度制作標準曲線，計算獲得MDA的含量。

1.8 數據統(tǒng)計與分析

用SPSS 20.0軟件one-way ANOVA法進行方差分析和顯著性檢驗。每組至少重復3次，數據用“平均值±標準差”表示。P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著。

2 結果

2.1 高濃度葡萄糖對卵丘細胞擴散的影響

卵丘細胞擴散是卵母細胞成熟的標志之一。COCs體外成熟42 h后，C組的卵丘細胞擴散效果較好(圖1 A)，而高濃度葡萄糖組的卵丘細胞擴散效果極差(圖1 B、圖1 C)。高濃度葡萄糖組的COCs卵丘擴散為3-級、4-級的數量，極顯著低于C組的數量(圖1 D)。說明高濃度葡萄糖抑制了卵丘細胞的擴散。

A.空白對照組(C)COCs；B.高濃度葡萄糖組1(G-1)COCs；C.高濃度葡萄糖組2(G-2)COCs；D COCs卵丘擴散為3-級、4-級的數量統(tǒng)計；**表示差異極顯著(P<0.01)。下同圖1 高濃度葡萄糖對卵丘細胞擴散的影響

2.2 高濃度葡萄糖對卵母細胞成熟的影響

如表1所示，卵母細胞體外成熟42 h后，高濃度葡萄糖(G-1、G-2)組的死亡率和成活率，與空白對照組(C組)相比均無顯著差異(P>0.05)。此外，與C組相比，G-1組第一極體率顯著下降(P<0.05)，G-2組極體率極顯著下降(P<0.01)。結果表明，高濃度葡萄糖降低了第一極體的排出率，并且隨著濃度的升高，第一極體的排出率會逐漸降低，但對于卵母細胞的成活沒有顯著影響。

表1 高濃度葡萄糖對卵母細胞體外成熟的影響

2.3 高濃度葡萄糖對MII期卵母細胞線粒體分布的影響

經高濃度葡萄糖處理過后，MII期卵母細胞線粒體分布如圖2所示。在C組中，線粒體均勻分散在胞質中，而在G-1、G-2組中，線粒體出現了分布不均的情況。

圖2 高濃度葡萄糖對卵母細胞線粒體分布的影響

2.4 高濃度葡萄糖對MII期卵母細胞ROS的影響

G-1、G-2中高濃度葡萄糖體外成熟環(huán)境下的卵母細胞ROS水平明顯升高(圖3 A、圖3B和圖3C)。熒光強度進一步分析發(fā)現，G-1、G-2的ROS水平極顯著高于C組(圖3 D，P<0.01)。

A.空白對照組(C)；B.高濃度葡萄糖組1(G-1)；C.高濃度葡萄糖組2(G-2)；D.卵母細胞ROS熒光強度統(tǒng)計圖3 高濃度葡萄糖對卵母細胞ROS水平的影響

2.5 高濃度葡萄糖對MII期卵母細胞GSH和MDA含量的影響

與C組相比，G-1組GSH含量顯著降低(P<0.05)，G-2組GSH含量極顯著降低(P<0.01)，見圖4 A。G-1組MDA含量與C組相比，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但有一定的升高趨勢；G-2組MDA含量比C組顯著升高(P<0.05)，見圖5 B。

A.GSH含量統(tǒng)計；B.MDA含量統(tǒng)計；*表示差異顯著(P<0.05)圖4 高濃度葡萄糖對卵母細胞GSH和MDA含量的影響

2.6 高濃度葡萄糖對孤雌胚胎發(fā)育的影響

如表2所示，G-1、G-2組比C組胚胎的2-細胞率顯著降低(P<0.05)，4-細胞率呈極顯著降低(P<0.01)，囊胚率也呈極顯著降低(P<0.01)。表明高濃度葡萄糖對卵母細胞存在一定的毒害作用，并且會持續(xù)到胚胎發(fā)育階段。

表2 高濃度葡萄對卵母細胞孤雌胚胎發(fā)育的影響

如圖5所示，G-1、G-2組的卵母細胞發(fā)育形成的囊胚，與C組的卵母細胞發(fā)育形成的囊胚相比，在細胞數量上沒有顯著差異(P>0.05)。表明高葡萄糖濃度環(huán)境下的體外成熟雖然會降低胚胎的發(fā)育率，但是對已形成囊胚的發(fā)育沒有顯著的影響。

A.空白對照組(C)囊胚；B.高濃度葡萄糖組1(G-1)囊胚；C.高濃度葡萄糖組2(G-2)囊胚；D.囊胚細胞數統(tǒng)計圖5 葡萄糖濃度對卵母細胞孤雌囊胚細胞數的影響

3 討論

試驗結果表明，高濃度葡萄糖的體外成熟環(huán)境會影響卵母細胞成熟，對卵丘細胞的擴散也有明顯地不利影響。它不僅引起卵母細胞內線粒體分布發(fā)生變化及ROS水平升高，導致了第一極體的排出減少，而且降低了胚胎的發(fā)育能力。

在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞擴散是卵母細胞成熟的關鍵過程，卵丘細胞通過縫隙連接對卵母細胞進行營養(yǎng)輸送與廢物代謝，同時卵母細胞也會通過釋放生長因子促進卵丘細胞的生長，卵丘細胞和卵母細胞通過這種互作，來促進卵母細胞的成熟[21]。COCs的縫隙連接是由縫隙連接蛋白組成的一種跨膜結構[22]，而I型糖尿病小鼠中，縫隙連接蛋白的表達降低，縫隙連接受損，不僅導致卵母細胞的成熟受到抑制，并且影響卵丘細胞的生長分化[21]。在豬COCs的成熟中，卵丘細胞的擴散異常會導致卵母細胞的成熟和發(fā)育能力降低[23]。本試驗結果也表明，在高葡萄糖濃度環(huán)境下，COCs體外成熟后，卵丘細胞擴散受阻，說明高葡萄糖濃度的成熟環(huán)境可能影響了卵丘細胞與卵母細胞之間的正常交流，從而抑制了卵母細胞的正常成熟。

卵母細胞的質量將會影響早期胚胎的存活，懷孕的建立和維持，胎兒的發(fā)育，甚至成年疾病[24]。豬體外成熟卵母細胞的細胞核成熟和細胞質成熟極易不同步[25]，造成卵母細胞質量下降。卵母細胞在細胞核和細胞質的成熟過程中，對葡萄糖濃度具有一定的依賴性，而且葡萄糖濃度對減數分裂的恢復和第一極體的排出有著重要的作用[26-27]。COCs的葡萄糖代謝主要是通過卵丘細胞進行的，卵丘細胞代謝后產生丙酮酸可被卵母細胞直接利用，COCs的縫隙連接受損后，丙酮酸向卵母細胞的輸送受阻，同時導致線粒體的分布不均，引起供能不足，從而影響卵母細胞成熟[7]。高葡萄糖濃度環(huán)境下會導致葡萄糖代謝的改變，通過葡萄糖代謝途徑磷酸戊糖途徑(PPP)，對卵母細胞的減數分裂的恢復產生影響，PPP途徑代謝增強，導致減數分裂的過早恢復，卵母細胞無法正常成熟，第一極體排出減少；同時糖酵解活性改變，會導致活性氧的增加，造成卵母細胞損傷[14,16,28]。ROS、MDA水平的增加，表明卵母細胞本身產生了氧化應激，同時抗氧化物GSH的水平顯著降低，容易導致原本的平衡狀態(tài)被打破，一旦超過其本身的處理能力，會導致卵母細胞的損傷，并且會引起細胞凋亡。進而損害人和牛卵母細胞發(fā)育能力[16,29]，高葡萄糖濃度環(huán)境會使己糖胺生物合成途徑通量增加，使細胞分裂和囊胚形成形成能力下降[30]。由于非洲豬瘟影響，卵巢的采集難度增加，采集時間增長，實驗室平均成熟效率與胚胎發(fā)育效率有所下降。因此，本試驗C組的成熟效率與孤雌胚胎的發(fā)育效率，比章美玲等[31]報道的結果低。雖然在高葡萄糖濃度成熟環(huán)境下，卵母細胞形成的囊胚細胞數與正常成熟環(huán)境下沒有顯著差異，但是其可能會在胚胎植入后產生不良影響，在小鼠中發(fā)現，胚胎植入后停止發(fā)育的概率增加[32]。本試驗進一步驗證，高葡萄糖濃度體外成熟環(huán)境，也會對豬卵及其胚胎發(fā)育能力造成損傷。