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    酶的制備與分析

    2019-08-26 04:43:22姜聯(lián)合編譯
    生物學(xué)通報(bào) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:酶類蓋子離心管

    姜聯(lián)合 編譯

    (中國科學(xué)院植物研究所 北京 100093)

    酶類是所有生物體自然產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)。作為催化劑,它們能將大的復(fù)雜的結(jié)合物分解為較小的因子,從而在機(jī)體中更易被利用。同樣,大量的復(fù)合物需要小分子酶類來分解。日常所知的洗衣液、胰島素等都是酶類的一種,食品、藥品、化妝品都有酶的影子。酶是怎樣產(chǎn)生的?又有哪些類別,都應(yīng)用在何處?一起來制作一個(gè)生物反應(yīng)器,學(xué)習(xí)檢測分析酶類的方法。

    1 背景知識

    根據(jù)酶類分解的物質(zhì)對酶進(jìn)行分類。例如,纖維素酶能將纖維素分解為單糖;蛋白酶是一種能將明膠這類物質(zhì)分解的酶類;過氧化氫酶能分解過氧化氫:H2O2→2H2O+O2。

    當(dāng)處于合適的溫度和pH值時(shí),酶類才具有活性??筛鶕?jù)這些特點(diǎn)考慮酶類是否能運(yùn)用在商業(yè)中。商業(yè)上使用的酶類都是從生物反應(yīng)器中的細(xì)菌和真菌體內(nèi)分離得到的。

    生物反應(yīng)器是能繁殖大量微生物、生產(chǎn)所需產(chǎn)物的大容器。所需產(chǎn)物可以是醫(yī)藥行業(yè)所需的蛋白質(zhì),例如糖尿病患者所需的胰島素;也可以是工業(yè)上所需要,用于軟化紙張、制作奶酪,或者是讓藍(lán)色牛仔服褪色;也可能是家庭所需的如用于軟化肉類的蛋白質(zhì)酶和洗衣液。生物反應(yīng)器必須包括以下條件:首先,必須能被完全滅菌;其次,能提供一個(gè)微生物繁殖并產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物的環(huán)境;有一個(gè)進(jìn)氣口、一個(gè)排氣口、一個(gè)加樣口,以及一個(gè)安置測量電極的路徑。影響生物反應(yīng)器效率的因素包括:培養(yǎng)物的純度、使用的介質(zhì)、溫度、pH值、溶氧量和二氧化碳含量。

    2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

    1)描述能影響微生物生長和代謝產(chǎn)物成分的因子;

    2)掌握檢測現(xiàn)有酶類的方法。

    3 裝備生物反應(yīng)

    3.1 實(shí)驗(yàn)材料 衛(wèi)生紙、5 L 10%消毒液、5 L桶;1.25 L飲料瓶(空的且潔凈)、玻璃棒或鈍探針、酒精燈、1 m潔凈的水管、氣石、鋒利的剪刀或刀片、硅膠塞、15 L無菌水、橡皮圈、大紙夾鑷子、燒杯、液體酒精、裝在密封瓶子里的消毒棉(用鋁箔紙封口,在160℃烘箱中滅菌2 h)、空氣泵。

    3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

    1)用衛(wèi)生紙蘸取稀釋的消毒劑,擦拭實(shí)驗(yàn)臺;

    2)用酒精燈加熱鈍探針或玻璃棒的一端,在飲料瓶的上端打3個(gè)等距的孔,每個(gè)孔將安裝干凈的水管;

    3)用剪刀或刀片將水管切成以下長度:排氣管12 cm、上樣管30 cm、充氣管50 cm;

    4)將每個(gè)水管插到對應(yīng)的孔中(圖1):排氣管應(yīng)將一半以上插入瓶中,上樣管應(yīng)插入到接近卻不碰到瓶底,充氣管應(yīng)該接觸到瓶底;

    圖1

    5)將接通空氣的管子與充氣管的末端接在一起;

    6)用硅膠塞將管口密封,可用橡膠圈將管子固定;放置 24~48 h;

    7)帶上手套;

    8)用衛(wèi)生紙蘸取稀釋的消毒劑,擦拭實(shí)驗(yàn)臺;

    9)在燒杯中加入液體酒精,并將鑷子浸沒其中;

    10)將桶里加入10%消毒液,將瓶子和瓶蓋浸沒在其中至少10 min;

    11)倒掉消毒液;

    12)用冷的無菌水沖洗3次;

    13)蓋上瓶蓋,用夾子夾住折過來的上樣管達(dá)到密封效果;

    14)用滅菌的鑷子將消毒棉輕輕塞入進(jìn)排氣管和充氣管的末端,并將充氣管與空氣泵連接。

    4 生物反應(yīng)器接種

    4.1 實(shí)驗(yàn)材料 天平、2個(gè)稱量盤、15 g糖、1 g酵母膏、350 mL蒸餾水、加熱板、400 mL帶塞子的錐形瓶、漏斗、1 L 10%消毒液、3 L無菌水;pH試紙或者 pH 計(jì)、0.1 mol/L HCl、1 袋(7 g)活性酵母(釀酒酵母)。

    4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

    15)用衛(wèi)生紙蘸取稀釋的消毒劑,擦拭實(shí)驗(yàn)臺;

    16)將350 mL蒸餾水加入錐形瓶;

    17)用天平稱取糖與酵母膏;

    18)將糖和酵母膏加入錐形瓶并加熱至沸騰;

    19)測量溶液的pH值,如果高于5.4,就慢慢加入鹽酸讓pH值降至5.4;

    20)煮沸15 min,然后蓋上蓋子,冷卻;

    21)用桶中稀釋的消毒液將漏斗消毒,然后用無菌水清洗3次;

    22)快速打開瓶蓋,將漏斗插入,將肉湯灌入生物反應(yīng)器;

    23)蓋上蓋子并開始充氣,這便能產(chǎn)生一個(gè)正壓,使得其他的微生物很難進(jìn)入;

    24)再次將蓋子打開,插入漏斗,并加入一袋酵母粉;

    25)將蓋子蓋緊。

    5 分析酶的產(chǎn)量

    5.1 實(shí)驗(yàn)材料 10 mL注射器、消毒棉、3% 過氧化氫液、移液管、帶蓋子的瓶子(比微量離心管大的)、2個(gè)顯微鏡載玻片、1個(gè)蓋玻片、微量離心管、秒表或計(jì)時(shí)器、在培養(yǎng)皿中倒入5 mm厚的含有紅色食用色素的明膠、滴管、2根試管、試管架、將0.33 g肉類軟化劑溶解在10 mL水中、透射光學(xué)顯微鏡(物鏡放大倍數(shù)為40倍)、100 mL 10%消毒液、100 mL量筒。

    5.2 實(shí)驗(yàn)步驟 分析從接種的當(dāng)天及其后3 d分別進(jìn)行。必須每天攪拌樣品數(shù)次。

    26)打開上樣管的夾子,接上10 mL注射器并抽取大約3 mL發(fā)酵液棄去;

    27)抽取10 mL發(fā)酵液。夾上夾子,取下注射器并塞上消毒棉。

    6 過氧化氫酶分析

    28)向微量離心管中加入0.5 mL發(fā)酵液;

    29)加入0.5 mL 3%的過氧化氫溶液;

    30)立刻蓋上離心管的蓋子然后置于一個(gè)帶有蓋子的容器中;

    31)如果產(chǎn)生大量的氣泡,則說明含有過氧化氫酶;

    32)記錄下從開始到產(chǎn)氣量達(dá)到最高的時(shí)間,如果超過半小時(shí)即可停止分析;

    33)將用過的離心管放入裝有消毒液的桶中。

    7 蛋白酶分析

    34)用吸管從含有明膠的培養(yǎng)皿中取適量明膠放入一根試管中;

    35)重復(fù)上述操作,將明膠放入第2根試管;

    36)在第1根試管中加入1 mL發(fā)酵液;

    37)在第2根試管中加入1 mL肉湯;

    38)記錄溶解明膠塊所需的時(shí)間;

    39)將用過的試管放在裝有消毒液的桶中。

    8 顯微鏡觀察

    40)在載玻片上滴1~2滴培養(yǎng)物,蓋上蓋玻片;

    41)將用過的注射器放入裝有消毒液的桶中;

    42)調(diào)節(jié)透射顯微鏡至低倍鏡;

    43)將載玻片放在顯微鏡載物臺上,畫下并標(biāo)記出所觀察到的;

    44)調(diào)節(jié)顯微鏡至高倍鏡,畫下并標(biāo)記出所觀察到的;

    45)將用過的玻片放在裝有消毒液的桶中。

    9 思考題

    1)微生物在需氧的液體環(huán)境中生長需要哪些必要的條件?(提供氧氣和攪拌。)

    2)為什么在厭氧環(huán)境微生物不能產(chǎn)生酶類?(酶的產(chǎn)生是依賴ATP的合成代謝途徑,而氧氣形成是合成酶所需ATP的前提。)

    3)舉例說明微生物產(chǎn)生的酶類和蛋白質(zhì)在工業(yè)上的應(yīng)用。(答案不唯一,在背景知識中提到過。)

    10 現(xiàn)實(shí)生活中生物反應(yīng)器的應(yīng)用

    生產(chǎn)酶類:酶類被廣泛用于食品行業(yè)、制造業(yè)、制藥業(yè)和家庭使用的化學(xué)物品中。

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