CaM/CaMKⅡ在腸易激綜合征大鼠腦腸互動(dòng)中的表達(dá)及大建中湯干預(yù)效應(yīng)研究＊

武 靜，鄭清海，王 慧，楊 毅，李堯鋒，王俊霞，楊莎莎

（1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 貴陽(yáng) 550002）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是常見的消化系統(tǒng)疾病，臨床上患者多以腹痛就診，其病理基礎(chǔ)為胃腸動(dòng)力和內(nèi)臟高敏性異常[1]。近年來(lái)研究證實(shí)CaMKⅡ在功能性胃腸病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，且參與痛覺(jué)過(guò)敏的形成，但作用機(jī)制不明。在此前提下本研究根據(jù)腦腸互動(dòng)學(xué)說(shuō)，將靶標(biāo)定位到腦、腸，分別檢測(cè)大鼠下丘腦和結(jié)腸CaM 信號(hào)通路關(guān)鍵基因CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白的表達(dá)，從而探討腸易激綜合征內(nèi)臟痛的形成機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探討大建中湯對(duì)腸易激綜合征的治療機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大 鼠，雌 鼠16 只，雄 性8 只，體 質(zhì) 量（150-170）g，由達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK2019-15。自由飲食1 周后，為使雌鼠有效懷孕，分別將2 只雌鼠和1 只雄鼠放在一籠，雌鼠懷孕后再分開喂養(yǎng)。選擇48 只雄性乳大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 藥物及試劑

大建中湯（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供）按比例（蜀椒∶干姜∶人參∶飴糖=1∶2∶1∶5）分別制成含生藥1.5 g·mL-1劑量濃度的水浸液；匹維溴銨片（MYLAN LABORATORIES SAS 公司，批準(zhǔn)文 號(hào)H20160396）；佐劑液態(tài)鋁（Pierce 公司，批號(hào)QD218415 A）；卵清白蛋白（Sigma 公司，批號(hào)052K1275）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZB-2301）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)PC0020）；蛋白質(zhì)定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)P1511）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)0000042197）；Cam/CaMKⅡ引物（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.3 儀器

石蠟包埋機(jī)（湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司，型號(hào)：YB-6D），石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：RM2135），電子恒溫水浴鍋（上海勝衛(wèi)電子科技有限公司，型號(hào)：J-HH-4A），光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司，型號(hào)：80i），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer 公司，型號(hào)：EnSpire），Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Media Cybernetics 公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：GelDoc2000）。

2 方法

2.1 模型制備

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2]改良制備IBS 內(nèi)臟痛大鼠模型。從出生第2 天起母嬰分離每天3 h（8:00-11:00），不予哺乳，正常組母子同籠；第8-21 天增加0.5%乙酸直腸內(nèi)刺激，每天1 次，每隔2 天增加0.1 mL，直至0.5 mL為止，正常組等量生理鹽水灌腸。至第22 天起，正常飼養(yǎng)至第41 天；第42、46 天分別予腹腔注射30 g·L-1OVA 1 mL，正常組注射等量PBS；第47-57 天正常飼養(yǎng)。第58 天進(jìn)行腹壁撤退反射（Abdominal withdrawal reaction，AWR）檢測(cè)，評(píng)價(jià)內(nèi)臟敏感性。

2.2 AWR檢測(cè)

分別給予80、60、40、20 mmHg 壓力，觀察結(jié)直腸擴(kuò)張（Colorectal distension，CRD）所產(chǎn)生的反應(yīng)。每次擴(kuò)張時(shí)間為20 s，重復(fù)6 次，每次間隔4 min，取6 次平均值。給與不同刺激時(shí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Al-chaer[3]，0分，大鼠情緒穩(wěn)定；1分，偶有扭動(dòng)頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮；3分，腹背肌肉收縮的基礎(chǔ)上出現(xiàn)腹部抬離地面；4分，腹部高離地面致使腹部呈弓狀。

2.3 分組及給藥

將造模成功的大鼠分為模型組，匹維溴銨對(duì)照組，大建中湯高、中、低劑量治療組，每組8只。大建中湯組、匹維溴銨予相應(yīng)藥物混懸液灌胃，正常組和模型組分別給予等量0.9%生理鹽水灌胃，給藥2 周，并再次AWR檢測(cè)。

2.4 取材

禁食12 h 后采用腹腔注射戊巴比妥鈉（0.4%，10 mL·kg-1）麻醉，冰臺(tái)上迅速取腦，分離下丘腦組織；同時(shí)切開腹腔在距離肛門7 cm 處取結(jié)腸3 cm，分3 段保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 RT-PCR 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸、下丘腦組織CaM/CaMKⅡ基因表達(dá)

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作，提取總RNA 及反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA，放置于-20℃保存?zhèn)溆?。目?biāo)基因引物：CaMKⅡ引物序列，上游：5'-GATGTGCGACCCT GGAATGA-3'，下 游：5'-ATGTAGGCGATGCAGGCT GAC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度：183 bp；CaM 引物序列，上游：5'-TCAGAACCCAACAGAGGCTGAA-3'，下游：5'-GTCA AAGACTCGGAATGCCTCAC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度：160 bp；βactin 引物序列，上游：5'-GGAGATTACTGCCCTGGC TCCTA-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC TG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度：150 bp。以β-Actin 作為內(nèi)參基因，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值后，用比較Ct值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.6 Western blot 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸、下丘腦組織CaM/CaMKⅡ蛋白表達(dá)

分別將結(jié)腸、下丘腦組織裂解剪成碎片勻漿，離心后提取組織蛋白；采用BCA 方法在標(biāo)準(zhǔn)曲線上定量檢測(cè)目的蛋白；制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜后免疫檢測(cè)：將PVDF膜加入適量封閉液，放入相應(yīng)的一抗溶液，37℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，搖床上洗膜3次，將洗好的PVDF膜放于配制好的二抗溶液，搖床上孵育2 h 再洗膜；采ECL 法顯色，并根據(jù)不同顯影光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析，以βactin 與目的蛋白密度比值作為待測(cè)目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）。多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較，采用最小顯著差法（Least-Significant Difference，LSD）法。如樣本資料不符合方差分析的條件，則采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠進(jìn)食正常，毛發(fā)光澤，行動(dòng)靈活；造模大鼠失去光澤，行動(dòng)遲緩，喜好扎堆，收腹、舔舐腹部等現(xiàn)象；灌服大建中湯和匹維溴銨后，大鼠進(jìn)食和毛發(fā)恢復(fù)正常，舔舐腹部現(xiàn)象消失。

3.2 對(duì)IBS內(nèi)臟痛大鼠模型腹痛的影響

與正常組比較，模型組AWR 評(píng)分在60、40、20 mmHg 壓力下增加，腸道痛覺(jué)明顯上升（P＜0.05、P＜0.01），證明成功造模。與模型組相比，AWR 評(píng)分在40、20 mmHg 壓力下，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組明顯降低（P＜0.05、P＜0.01），模型大鼠腸道痛覺(jué)減輕。與匹維溴銨組相比，在40 mmHg 壓力下的AWR評(píng)分，大建中湯高劑量組治療效果要優(yōu)于匹維溴銨組（P＜0.05）（表1）。

表1 大建中湯對(duì)IBS內(nèi)臟痛模型大鼠AWR評(píng)分的影響（xˉ± S，n = 8）

3.3 對(duì)IBS內(nèi)臟痛模型大鼠結(jié)腸HE染色的影響

正常組的結(jié)腸上皮組織完整，黏膜連續(xù)，淋巴細(xì)胞散在，未見水腫和潰瘍，未見明顯病理改變。模型組結(jié)腸組織黏膜層不連續(xù)，腺體輕度水腫，固有層內(nèi)散在分布少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等。匹維溴銨組和大建中湯組大鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，腺體排列規(guī)則，固有層及黏膜肌層結(jié)構(gòu)清晰，固有層內(nèi)有大量大腸腺分布，杯狀細(xì)胞數(shù)量正常，肌層和漿膜層未見明顯變性壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。提示大建中湯能夠顯著減輕模型大鼠腸道炎癥、改善損傷（圖1）。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)（HE×100）

3.4 對(duì)IBS 內(nèi)臟痛模型大鼠結(jié)腸、下丘腦CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 和Western Blot 技術(shù)檢測(cè)顯示，與正常組相比，模型組結(jié)腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組結(jié)腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.01）（表2、表3）。

4 討論

雖然腸易激綜合征的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為心理因素通過(guò)影響胃腸道黏膜屏障、感覺(jué)等生理功能，從而改變IBS患者的疾病體驗(yàn)和行為，因此提出“腦腸互動(dòng)”假說(shuō)，其互動(dòng)調(diào)節(jié)失常與IBS 發(fā)生關(guān)系密切[4,5]。腦腸互動(dòng)是胃腸道將各種刺激信號(hào)通過(guò)脊髓背根神經(jīng)節(jié)及脊髓背角神經(jīng)元突觸，將內(nèi)臟信息投射到感覺(jué)信息處理中樞下丘腦。下丘腦整合內(nèi)臟信息后，由自主神經(jīng)系統(tǒng)借傳出神經(jīng)元將調(diào)控信息傳送到腸神經(jīng)或直接作用于腸效應(yīng)細(xì)胞，故本實(shí)驗(yàn)將靶標(biāo)定位在下丘腦和結(jié)腸，探討腦腸之間的互動(dòng)機(jī)制。

表2 大建中湯對(duì)IBS內(nèi)臟痛模型大鼠結(jié)腸、下丘腦CaM/CaMKⅡmRNA的影響（xˉ± S，n = 8）

表3 大建中湯對(duì)IBS內(nèi)臟痛模型大鼠結(jié)腸、下丘腦CaM/CaMKⅡ蛋白的影響（xˉ± S，n = 8）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IBS 病位在脾胃，病因有氣滯、感寒、血凝、蟲積等，病機(jī)為脾胃虛寒，運(yùn)化乏力，氣血不足“不榮則痛”及氣機(jī)阻滯，氣血經(jīng)脈運(yùn)行不暢“不通則痛”?！督鹭乙浴酚涊d的大建中湯是治療腹痛的經(jīng)典方劑，其由干姜、人參、蜀椒、飴糖組成，針對(duì)腹痛病位在脾胃，脾胃虛寒之證，具有健脾止痛、溫中散寒之功。臨床研究也表明大建中湯能夠治療多種急慢性內(nèi)臟痛，療效確切[6]。

內(nèi)臟高敏被認(rèn)為是IBS 的最重要的病理基礎(chǔ)，本研究結(jié)果表明，造模大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、收腹、舔舐腹部、肛周污濁等現(xiàn)象，符合IBS 內(nèi)臟痛癥狀。IBS 內(nèi)臟痛大鼠AWR 評(píng)分中4個(gè)擴(kuò)張壓力均有明顯升高，表明模大鼠腸道在長(zhǎng)期的傷害性刺激下形成IBS慢性內(nèi)臟痛，由于中樞以及外周的雙重疼痛敏化，大鼠痛閾降低，痛行為表現(xiàn)明顯。與模型組比較，經(jīng)大建中湯治療后，大鼠在4 個(gè)擴(kuò)張壓力下均明顯降低，趨于正常。表明大建中湯治療能夠使IBS 內(nèi)臟痛大鼠痛閾升高，痛行為改善，提示大建中湯對(duì)內(nèi)臟痛大鼠有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

CaM 是重要的細(xì)胞信號(hào)傳遞物質(zhì)，其與Ca2+形成Ca2+-CaM 復(fù)合物實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]?，F(xiàn)已證明Ca2+-CaM 信號(hào)通路廣泛存在于多種真核細(xì)胞內(nèi)，Ca2+通過(guò)與CaM 結(jié)合，激活Ca 激酶Ⅱ（Ca2+-CaM 依賴的蛋白激酶Ⅱ）發(fā)揮作用。研究[8]表明Ca2+/CaMKⅡ是一種多功能CaM 激酶，可在細(xì)胞內(nèi)被激活，在全身各組織內(nèi)廣泛分布。CaMKⅡ特有的身磷酸化機(jī)制可形成突觸后膜長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)（Long-term potentiation,LTP），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性變化中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ尚參與痛覺(jué)過(guò)敏的形成，且在功能性胃腸病的發(fā)病中亦發(fā)揮重要作用[9]。本實(shí)驗(yàn)中，課題組采用母子分離、乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射等復(fù)合造模方法，成功復(fù)制IBS 內(nèi)臟痛大鼠模型。與正常組相比，模型組結(jié)腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組結(jié)腸、下丘腦組織中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出了CaM/CaMKⅡ在下丘腦和結(jié)腸中含量變化的同步性，不僅進(jìn)一步表明CaM/CaMKⅡ與腸易激綜合征的發(fā)病密切相關(guān)，同時(shí)也證實(shí)了“腦腸互動(dòng)”學(xué)說(shuō)。大建中湯能夠通過(guò)抑制CaM/CaMKⅡ含量水平，降低IBS內(nèi)臟痛覺(jué)高敏狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，在40 mmHg 壓力下AWR 評(píng)分下大建中湯組優(yōu)于匹維溴銨組，這可能與大建中湯的多靶點(diǎn)鎮(zhèn)痛作用有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[10]，大建中湯可通過(guò)抑制神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 產(chǎn)生和釋放，下調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)5-HTP、5-HIAA 含量，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，而匹維溴銨針對(duì)上述疼痛靶點(diǎn)的作用尚未相關(guān)報(bào)道。

本課題組從CAMKⅡ信號(hào)途徑關(guān)鍵分子角度揭示腸易激綜合征的發(fā)病機(jī)制以及大建中湯作用機(jī)制和科學(xué)內(nèi)涵，基于“腦腸互動(dòng)”及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論探索腸易激綜合征內(nèi)臟痛的發(fā)生機(jī)制，有助于尋找到中醫(yī)藥治療IBS 內(nèi)臟痛的作用藥靶部位，將為加快研發(fā)治療IBS內(nèi)臟痛的有效中醫(yī)復(fù)方制劑提供科學(xué)依據(jù)。