四神丸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠及離體結(jié)腸的實(shí)驗(yàn)研究＊

劉 敏，薛 紅，胡運(yùn)蓮

（1. 三亞市人民醫(yī)院 三亞 572000；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091；3. 湖北省中醫(yī)院 武漢 430030）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見(jiàn)的功能性腸道病變，因應(yīng)激事件誘發(fā)，主要表現(xiàn)為腹痛、腹脹、腹瀉、便秘等癥狀，國(guó)際通常依照出現(xiàn)腹瀉或者便秘將IBS 分為四型（腹瀉型、便秘型、混合型和不定型），在我國(guó)腹瀉型腸易激綜合征（IBS with predominant diarrhea，IBS-D）患者較多，占到整個(gè)IBS 發(fā)病率的66.3%[1,2]。IBS-D 常常反復(fù)發(fā)作，由于缺乏理想的藥物治療，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成很大影響，因此亟需療效確切的治療藥物。

四神丸最早見(jiàn)于宋·陳文中所著的《陳氏小兒痘疹方論》，由補(bǔ)骨脂、肉豆蔻、吳茱萸、五味子、大棗和生姜組成，是治療脾腎陽(yáng)虛泄瀉的經(jīng)典方。中醫(yī)認(rèn)為腎陽(yáng)虧虛，脾失溫煦，運(yùn)化失司，發(fā)為泄瀉是IBS-D 的病機(jī)變化特點(diǎn)[3]，因此四神丸的藥性契合IBS-D 的病機(jī)，文獻(xiàn)也顯示以四神丸為基礎(chǔ)方的加減治療IBS-D臨床療效較佳[4,5]。由于缺乏較好的IBS-D動(dòng)物模型和評(píng)價(jià)方法，IBS-D 的發(fā)病和病理生理變化還有待深入探究，目前四神丸對(duì)IBS-D 的藥理作用特點(diǎn)和作用機(jī)制還不清楚[6]。近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道了改良的IBS-D 動(dòng)物模型和評(píng)價(jià)方法，也發(fā)現(xiàn)IBS-D 發(fā)生與胃腸道動(dòng)力調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)[7,8]。本研究擬采用母子分離聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激和番瀉葉灌胃法建立IBS-D 大鼠模型評(píng)價(jià)四神丸的作用效應(yīng)，并通過(guò)觀察四神丸對(duì)離體結(jié)腸動(dòng)力作用來(lái)揭示四神丸的作用機(jī)制，為四神丸臨床應(yīng)用治療IBS-D提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 孕鼠10 只，孕期（18 ± 2）天，由思科貝（北京）生物技術(shù)有限公司提供，合格證編號(hào)：SCXK（京）2016-0002。造模全部使用新生雄鼠（飼養(yǎng)地點(diǎn)：湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；飼養(yǎng)條件：Ⅱ級(jí)，室溫22-25℃，相對(duì)濕度45%-60%，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 試劑和藥物

四神丸，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司，批號(hào)17090012，規(guī)格：27 g/瓶，研碎后過(guò)篩，用蒸餾水配制成0.72 g·mL-1、0.36 g·mL-1、0.18 g·mL-1的混懸液用于灌胃，放入4℃冰箱，備用。匹維溴銨片，法國(guó)蘇威制藥公司，規(guī)格: 50 mg/片，研碎后過(guò)篩，配制成1.5 mg·mL-1的藥液備用。番瀉葉（湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供并進(jìn)行質(zhì)量鑒定），水煎過(guò)濾濃縮成1g 生藥/mL 的藥液。其他試劑均由Sigma-Aldrich中國(guó)公司提供。

1.3 儀器

自制大鼠束縛網(wǎng)和帶氣囊的腸壁增壓管（可通過(guò)三通管測(cè)定壓力）；BIOPAC 生理記錄儀采集系統(tǒng)（美國(guó)BIOPAC公司）；張力換能器（成都儀器廠）。

2 方法

2.1 模型制備與分組

選擇由孕鼠生出的90 只SD 雄性乳大鼠，選取15只作為對(duì)照組，其余75 只參照文獻(xiàn)[7,8]建立IBS-D 大鼠模型，將造模乳鼠從出生第2 天始每天上午與母鼠分開(kāi)3 h，進(jìn)行2周，對(duì)照組母子同籠。所有乳鼠出生3周后皆斷奶并與母鼠分開(kāi)放置，至大鼠體重達(dá)180 g 以上（大約7-8 周）后，采用自制束縛架對(duì)造模大鼠固定時(shí)間進(jìn)行制動(dòng)束縛3 h，連續(xù)3周（對(duì)照組不束縛）。造模大鼠在束縛應(yīng)激第2周結(jié)束后開(kāi)始給與番瀉葉水煎劑（1 g·kg-1）灌胃，進(jìn)行2 周，在此期間將造模動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、中藥組（SSW 高劑量組，SSW 中劑量組，SSW 低劑量組）、陽(yáng)性藥（匹維溴銨）組，在疊加番瀉葉灌胃的同時(shí)，四神丸高、中、低劑量組動(dòng)物每日按7.2 g·kg-1、3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1灌胃（分別相當(dāng)于成人等效劑量的4、2、1倍），匹維溴銨組按15 mg·kg-1（相當(dāng)于成人等效劑量的2 倍），連續(xù)灌胃4 周。模型組和對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。離體腸管實(shí)驗(yàn)直接將混懸液進(jìn)行稀釋后使用。

2.2 內(nèi)臟高敏感性的測(cè)定

異氟烷氣體麻醉后，將涂石蠟油的帶氣囊的增壓管插入肛門(mén)約6 cm，固定在尾根部，并把實(shí)驗(yàn)大鼠限制于透明盒中，待動(dòng)物清醒后，對(duì)球囊充氣模擬腸道對(duì)機(jī)械刺激的敏感性，造成直腸擴(kuò)張而引發(fā)大鼠腹壁逃避反射（abdominal withdrawal reflex，AWR），實(shí)驗(yàn)按照20、40、60、80 mmHg 四個(gè)壓力值進(jìn)行加壓，每4 min加壓20 s，每個(gè)壓力值重復(fù)觀察3 次，取平均值作為AWR 分值。AWR 分值的積分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，未見(jiàn)明顯變化；1 分，出現(xiàn)扭動(dòng)頭部等輕微不安變化，腹背部肌肉未見(jiàn)收縮；2 分，出現(xiàn)腹背部肌肉收縮，腹部未抬離地面；3分，出現(xiàn)腹背部肌肉較收縮，腹部抬離地面；4分，腹背部肌肉收縮，腹部呈弓狀彎曲，腹部抬離地面。將AWR評(píng)分為3分時(shí)的壓力閾值作為疼痛閾值。

2.3 糞便粒數(shù)和腹瀉指數(shù)

單獨(dú)放置大鼠，在固定時(shí)間籠內(nèi)放置濾紙，保存4 h，記錄每只大鼠糞便粒數(shù)，排稀便次數(shù)、糞便污跡的直徑等腹瀉情況，并計(jì)算腹瀉指數(shù)（稀便率×平均稀便級(jí)）。稀便率是指每只大鼠所排稀便數(shù)（污跡數(shù)）與總便數(shù)（糞便粒數(shù)+污跡數(shù)）之比；稀便級(jí)是指稀便污跡面積的大小，按照污跡直徑分為四級(jí)：＜1 cm 為一級(jí)，1-2 cm 為二級(jí)，2-3 cm 為三級(jí)，＞3 cm 為四級(jí)。平均稀便級(jí)=稀便級(jí)數(shù)總和/污跡數(shù)。

2.4 大鼠離體腸管實(shí)驗(yàn)

取15 只雄性成年大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，不禁水，脫頸后處死，取肛門(mén)遠(yuǎn)側(cè)3-5 cm 左右的結(jié)腸，剪成1.5 cm 小段，去除聯(lián)結(jié)的系膜和脂肪，洗凈腸管，放入Tyrode 液（NaCl 136，KCl22，CaCl21.8，MgCl21，NaHCO312，NaH2PO40.6，Glucose 5，HEPES 10，mmol·L-1pH =7.4）浴槽中，將2 個(gè)三角形金屬鉤各一邊穿過(guò)腸管，其中1 個(gè)固定浴槽底部，另1 個(gè)連接張力換能器，給予1.5 g 前負(fù)荷，穩(wěn)定90 min，每隔15 min 換Tyrode 液，浴槽內(nèi)溫度維持在（37 ± 0.5）℃，持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣，張力換能器連接到BIOPAC 生理記錄儀采集系統(tǒng)。首先觀察SSW 對(duì)腸管自發(fā)收縮作用的影響：等待腸管穩(wěn)定后，累積加入不同濃度SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1），觀察大鼠腸管的張力反應(yīng)；然后觀察SSW 對(duì)乙酰膽堿所致腸管收縮作用的影響：待腸管平穩(wěn)后向浴槽內(nèi)加入氯化乙酰膽堿（終濃度100 mmol·L-1），穩(wěn)定后向浴槽內(nèi)累積加入不同濃度的SSW混懸液，觀察大鼠腸管的張力反應(yīng)；最后觀察SSW 對(duì)高鉀所致腸管收縮作用的影響：待腸管平穩(wěn)后向浴槽內(nèi)加入無(wú)鈣高鉀Tyrode 液（正常Tyrode 液中的KCl 提高為60 mmol·L-1，并去除CaCl2），平穩(wěn)后加入高鈣高鉀Tyrode 液（正常Tyrode 液中的KCl 提高為60 mmol·L-1，CaCl2提高為100 mmol·L-1），穩(wěn)定后向浴槽內(nèi)累積加入不同濃度的SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1），觀察大鼠腸管的張力反應(yīng)。采用收縮抑制率反映藥物引起的張力變化，計(jì)算公式如下：收縮抑制率（%）=（T2 -T0）/（T1 - T0）×100%，其中T0表示基礎(chǔ)張力值，T1表示Ach 或高鉀加入后張力值，T2表示SSW 加入后張力值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

束縛前，各組大鼠狀態(tài)良好，自主活動(dòng)活躍皮毛有光澤，眼角無(wú)分泌物，耳廓呈淡粉色，大便干稀適中。束縛造模的3 h內(nèi)排便量減少，而在束縛期最后1周，給予番瀉葉灌胃后，模型組和給藥組都很快出現(xiàn)稀便，造模結(jié)束后，對(duì)照組大鼠自主活動(dòng)活躍，皮毛光潔，排便未見(jiàn)異常，模型組大鼠狀態(tài)差，自主活動(dòng)減少，抓取時(shí)反抗減弱，無(wú)光澤，眼角有分泌物，耳廓色淡，稀便明顯增加，給藥各組動(dòng)物一般狀態(tài)較模型組略好。各組實(shí)驗(yàn)大鼠部分脫落。

3.2 四神丸對(duì)IBS-D模型大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與正常組比較，模型組大鼠對(duì)20 mmHg 壓力下的AWR 評(píng)分和痛覺(jué)閾值具有顯著差異（P＜0.05），提示模型組大鼠腸道痛覺(jué)敏感性增高。但是20 mmHg 以上壓力下的AWR 評(píng)分無(wú)論正常組和模型組都明顯提高，無(wú)顯著差異（P＞0.05），提示高壓力下的AWR評(píng)分對(duì)評(píng)價(jià)腸管的痛覺(jué)敏感性的意義較差。與模型組比較，SSW 低、中、高劑量組及匹維溴銨組痛覺(jué)壓力閾值均明顯升高且差異顯著（P＜0.01）。SSW 中、高劑量組及匹維溴銨組在低壓力下（20 mmHg 和40 mmHg）的AWR 評(píng)分也表現(xiàn)出明顯差異（P＜0.05），提示四神丸可提高IBS-D模型大鼠腸道痛覺(jué)敏感性（表1）。

表1 四神丸對(duì)IBS-D模型的AWR評(píng)分的影響

3.3 四神丸對(duì)IBS-D模型大鼠腹瀉的影響

與正常組比較，模型組大鼠糞便粒數(shù)出現(xiàn)明顯增高（P＜0.01），而且糞便粒明顯變軟，并且出現(xiàn)稀便。與模型組比較，SSW 低、中、高劑量組及匹維溴銨組糞便粒數(shù)和腹瀉指數(shù)均明顯降低（P＜0.01或＜0.05），提示四神丸可減輕IBS-D模型大鼠的腹瀉（表2）。

表2 四神丸對(duì)IBS-D模型的糞便粒數(shù)和腹瀉指數(shù)的影響

3.4 四神丸對(duì)離體腸管的影響

平衡后可見(jiàn)離體腸管自發(fā)收縮舒張，加入梯度濃度SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1）后，結(jié)腸自發(fā)收縮張力曲線未見(jiàn)明顯變化。平衡后加入M 受體激動(dòng)劑氯化乙酰膽堿（Ach）（終濃度10-4mol·L-1），可見(jiàn)張力明顯增加，可維持20 min 未見(jiàn)明顯變化。進(jìn)入平臺(tái)期后按累加濃度法加入SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1），每個(gè)濃度作用5 min 后加入下一濃度。SSW 混懸液在1.5-6 g·L-1可呈劑量依賴(lài)性的減弱乙酰膽堿造成的腸管張力增加，圖1A 顯示一例SSW 對(duì)Ach 預(yù)收縮腸管呈劑量依賴(lài)性舒張作用張力變化圖，計(jì)算各個(gè)濃度的收縮抑制率，建立濃度舒張效應(yīng)曲線（圖1B）。其中1.5 g·L-1，3 g·L-1，6 g·L-1對(duì)Ach 收縮作用的收縮抑制率分別為（80.7 ± 10.4）%（n= 7），（52.5 ± 13.9）%（n= 8），（34.7 ± 16.8）%（n= 6），與相同時(shí)間點(diǎn)未加入SSW 比較差異顯著（P＜0.01）。平衡后加入無(wú)鈣高鉀Tyrode液可見(jiàn)自主舒縮減弱，重新平衡后加入高鈣高鉀Tyrode 液，可見(jiàn)張力明顯增加，20 min內(nèi)張力逐漸減弱至初始張力的70%以?xún)?nèi)，按累加濃度法加入SSW 混懸液（0.375-6 g/L），每個(gè)濃度作用5 min 后加入下一濃度。SSW 混懸液在0.75-6 g·L-1可呈劑量依賴(lài)性的減弱高鉀造成的腸管張力增加，圖2A 顯示一例SSW 對(duì)高鉀預(yù)收縮腸管呈劑量依賴(lài)性舒張作用張力變化圖，計(jì)算各個(gè)濃度的舒張率，建立濃度舒張效應(yīng)曲線（圖2B）。其中0.75 g·L-1，1.5 g·L-1，3 g·L-1，6 g·L-1對(duì)高鉀收縮作用的收縮抑制率分別為（72.6±4.1）%（n=8），（29.4±16.6）%（n=7），（11.2±10.8）%（n=8），（7.1±10.5）%（n=8），與相同時(shí)間點(diǎn)未加入SSW 比較差異顯著（P＜0.01）。

圖1 SSW對(duì)Ach預(yù)收縮腸管量效曲線

圖2 SSW對(duì)高鉀預(yù)收縮腸管量效曲線

4 討論

腹瀉型腸易激綜合征是臨床常見(jiàn)的消化內(nèi)科疾患，其臨床主要表現(xiàn)為晨起形寒肢冷，腹痛腹瀉，得溫痛減，并可伴有腰膝酸軟等癥狀，該病發(fā)病因素復(fù)雜，具體機(jī)制目前尚不完全清楚，大量文獻(xiàn)報(bào)道可能與腦－腸軸雙向調(diào)節(jié)功能紊亂、腸道菌群紊亂、胃腸動(dòng)力學(xué)失調(diào)、內(nèi)臟高敏感性等多種因素有關(guān)[9]。中醫(yī)臨床認(rèn)為IBS-D 可能與脾胃運(yùn)化功能失調(diào)有關(guān)，雖然病位在腸，但是涉及肝脾腎三臟，主要表現(xiàn)為脾腎陽(yáng)虛。作為治療脾腎陽(yáng)虛泄瀉的名方四神丸能夠溫腎暖脾，澀腸止瀉，用于脾腎虛寒，五更泄瀉，久泄不止等病癥的治療，近來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道以四神丸為基礎(chǔ)方對(duì)腹瀉型腸易激綜合征的治療優(yōu)于其他中西藥物[10-11]，但目前四神丸整體方劑的藥理學(xué)研究相對(duì)較少，原因可能是還缺乏一致公認(rèn)的IBS 動(dòng)物模型[12]，而制備良好的IBS動(dòng)物模型是研究發(fā)病機(jī)制、病理生理、藥物治療等方面的基礎(chǔ)。有報(bào)道采用慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉浸劑灌胃造模符合IBS-D 證型特點(diǎn)，是一種較好的造模方式[13]。本研究采用母子分離聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激造成不可預(yù)知輕度應(yīng)激并聯(lián)合番瀉葉灌胃法制備IBS-D 大鼠模型，結(jié)果顯示模型大鼠的腸道敏感性和腹瀉狀況均高于正常組，顯示這種造模方法能夠反應(yīng)IBS-D 的臨床特點(diǎn)，可以應(yīng)用與對(duì)IBS-D 的深入研究。不同劑量的SSW 和陽(yáng)性對(duì)照藥匹維溴銨治療4 周后，模型大鼠的痛覺(jué)壓力閾值明顯升高，而糞便粒數(shù)及腹瀉指數(shù)均明顯下降，說(shuō)明四神丸能夠從排便功能和內(nèi)臟敏感性?xún)蓚€(gè)方面改善IBS-D 的病理生理異常，且具有濃度依賴(lài)性。但是在使用評(píng)價(jià)內(nèi)臟敏感性指標(biāo)AWR 評(píng)分時(shí)我們發(fā)現(xiàn)低壓力下（20 mmHg上下）AWR評(píng)分變化比較顯著，高壓力下的AWR評(píng)分對(duì)評(píng)價(jià)腸管的痛覺(jué)敏感性的意義較差。只有聯(lián)合應(yīng)用AWR 評(píng)分和痛覺(jué)壓力閾值2個(gè)指標(biāo)，才能有效評(píng)價(jià)大鼠內(nèi)臟敏感性的改變。

既往研究發(fā)現(xiàn)IBS-D 患者在空腹和進(jìn)食后乙狀結(jié)腸動(dòng)力指數(shù)較正常人明顯增高，而且移行性高幅收縮波的波幅及持續(xù)時(shí)間也異于正常人，肌肉松弛劑可有效改善IBS 患者腹痛癥狀[14,15]，表明IBS-D 發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)的腹瀉和腹痛可能與腸道平滑肌功能紊亂造成張力異常密切相關(guān)，提示調(diào)節(jié)腸道平滑肌的張力異常有可能改善IBS-D 的癥狀。有研究表明四神丸對(duì)家兔離體腸管的自發(fā)活動(dòng)有明顯的抑制作用而且能夠?qū)笲aCl2引起的腸道平滑肌痙攣，提示四神丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道平滑肌的張力發(fā)揮藥效[16]。為進(jìn)一步探究四神丸對(duì)腸道平滑肌張力的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用電生理技術(shù)觀察了藥物對(duì)正常大鼠離體結(jié)腸腸管的舒縮功能的影響，結(jié)果顯示四神丸僅對(duì)乙酰膽堿或高鉀刺激的腸管痙攣性收縮具有濃度依賴(lài)性的抑制效應(yīng)，對(duì)正常的自發(fā)性舒縮無(wú)明顯影響，表明四神丸對(duì)正常狀態(tài)的腸功能影響相對(duì)較小，對(duì)收縮亢進(jìn)腸管產(chǎn)生緩解作用。Ca2+是腸道平滑肌的興奮-收縮偶聯(lián)者，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加可引起腸道平滑肌收縮。作為平滑肌內(nèi)興奮傳遞的化學(xué)遞質(zhì)乙酰膽堿能夠激動(dòng)平滑肌細(xì)胞表面的M 膽堿能受體，一方面啟動(dòng)受體依賴(lài)型Ca2+通道（RDC），另一方面活化磷酸酯酶C，提高使三磷酸肌醇的含量而啟動(dòng)受體操縱型Ca2+通道（ROC），來(lái)增加腸管的收縮幅度和張力。高鉀溶液可以引發(fā)電壓依賴(lài)性的鈣通道開(kāi)放，引起外鈣內(nèi)流而促進(jìn)內(nèi)鈣釋放引發(fā)平滑肌收縮[17]。四神丸對(duì)Ach 和高鉀刺激的腸管痙攣性的拮抗作用表明該藥可能既能通過(guò)抑制內(nèi)鈣釋放又能拮抗外鈣內(nèi)流緩解腸管的異常收縮。最近的報(bào)道顯示四神丸可能通過(guò)保護(hù)腸道黏膜屏障、抑制炎癥反應(yīng)、改善胃腸道運(yùn)動(dòng)、消化系統(tǒng)的分泌功能紊亂和腸道內(nèi)敏感性來(lái)達(dá)到治療腹瀉型腸易激綜合征的作用[18,19]，提示四神丸可通過(guò)多種途徑發(fā)揮作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，四神丸可能通過(guò)其有效成分抑制腸道平滑肌細(xì)胞的內(nèi)鈣釋放和拮抗外鈣內(nèi)流2種途徑拮抗腸道的張力異常，改善腸痙攣引起的內(nèi)臟敏感性增高和腸功能亢進(jìn)引發(fā)的腹瀉。本研究為四神丸治療IBS-D提供了藥理學(xué)依據(jù)。