陽明病（陽明腑實證）欲解時TNF-α的變化及大承氣湯干預(yù)作用的實驗研究＊

石 琳，李冰鵠，張廣梅，趙協(xié)慧，王樹林，陳湘宏，劉占厚，吳 萍

（青海大學醫(yī)學院 西寧 810001）

張仲景在《傷寒雜病論》首提六經(jīng)辨證論治體系，在六經(jīng)病學說中，陽明病隸屬于里證、實證，主要指病邪客于胃腸或邪氣源于胃腸的里實證?！秱摗?80條：“陽明之為病，胃家實也?！蔽讣?，包括足陽明胃以及手陽明大腸?！鹅`樞·本輸》謂：“大腸、小腸皆屬于胃?！睂嵞诵皻鈱崱ｊ柮魑父瓰樗戎?，多氣多血，陽明病易從燥化、熱化。陽明病主要以胃腸燥、熱、實為病變特征，當燥熱之邪與胃腸宿滯相搏，結(jié)成燥屎，以致腸道不通，而見腹?jié)M硬痛、不大便，甚或譫語、潮熱等，形成陽明腑實證。研究表明，陽明腑實證時存在嚴重的腸道屏障功能受損[1]，出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥（Intestinal endotoxemia，IETM）和腸道菌群移位，兩者作為誘發(fā)因子誘使機體炎癥反應(yīng)失控，進而表達、產(chǎn)生、釋放大量炎癥介質(zhì)[2-4]。

張仲景《傷寒論》提出的“欲解時”[5]概念是中醫(yī)天人相應(yīng)思想的進一步發(fā)展。傷寒論193 條：“陽明病，欲解時，從申至戌上。”認為申至戌時正是太陽西下，陽氣衰減之時，人體熱邪順應(yīng)陽氣衰減而下消，若加上正確有效的治療，有利于陽明熱邪外出，使病情發(fā)展趨于向好的時刻。大承氣湯出自張仲景的《傷寒雜病論》，具有竣下熱結(jié)之功，是瀉法的代表方劑[6]，也是治療陽明腑實證的主要方劑。研究表明，大承氣湯具有降低炎性細胞因子、抑制血清內(nèi)毒素、抗炎、提高機體免疫力等藥理作用，對重要組織臟器具有保護作用[7]。目前六經(jīng)病“欲解時”相關(guān)研究較少，本研究以陽明腑實證模型大鼠為研究對象，觀察陽明病“欲解時”（酉時）及其對時（卯時）TNF-α 含量的變化及大承氣湯干預(yù)效果，為臨床擇時治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠290 只，體質(zhì)量（178 ± 23）g，雌雄各半，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（陜）2017-003）。

1.1.2 試劑與儀器

TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒（美國云克隆生物研究所提供）。常規(guī)手術(shù)器械；超純水純化儀（Milli-Q，美國默克密理博有限公司）；DCNSG 多功能提取濃縮機組（上海達程實驗設(shè)備有限公司）；TDL5M 低速冷凍離心機；RT-2100 酶標儀與洗板機（深圳雷杜公司）；PY-2型恒溫箱（上海公私合營國光醫(yī)化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 分組

分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組90 只、模型組100只，大承氣湯組100只。

1.2.2 藥物制備

①造模熱藥液：根據(jù)實驗大鼠體質(zhì)量按每只20 g·kg-1體質(zhì)量計算總藥量，附子、肉桂、干姜以1:1:1量（購于青海省新綠洲藥業(yè)有限公司，由青海大學醫(yī)學院藥學系鑒定），加水浸泡30 min，水煎2 次（40 min/次），每次煎完用雙層清潔紗布過濾藥汁，將兩次煎液合并，加熱濃縮至含生藥量2 g·mL-1，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用時將藥液加熱至37℃。②糞便混懸液：收集大鼠自身糞便磨碎，置于蒸餾水中，配制成10%混懸液。③注射用LPS 制備：大腸桿菌LPS 使用前以1.6 g·L-1濃度溶于滅菌去離子水中。④大承氣湯液：芒硝、大黃、枳實、厚樸以3∶4∶5∶5 比例，枳實、厚樸加水浸泡30 min，水煎40 min 取汁，入大黃，水煎（2 - 3）min 取汁，入芒硝溶化，雙層清潔紗布過濾，加熱濃縮至2 g·mL-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 模型復制及給藥方法

參照樊新榮等[8]造模方法，建立陽明腑實證動物模型。

實驗第1-12天：模型組、大承氣湯組大鼠每天按每只20 g·kg-1劑量灌熱藥液，正常組灌等量蒸餾水，每5 天稱重1 次以調(diào)整藥量，連續(xù)灌胃12 天。第13-14天：禁食不禁水12 h 后，模型組、大承氣湯組大鼠給予自身糞便混懸液灌胃，2 mL/只，正常組灌等量蒸餾水，2 次/日，連續(xù)2 天。第15 日：正常組、模型組、大承氣湯組再次隨機分為欲解時組與非欲解時組，模型組、大承氣湯組欲解時組于當日14:00、非欲解時組于次日凌晨2:00 予以5 mg·kg-1脂多糖腹腔注射，正常組欲解時組當日14:00、非欲解時組次日凌晨2:00大鼠腹腔注射生理鹽水。

模型判定：①大鼠進食量較少，行動遲慢，精神萎靡不振，體質(zhì)量略有下降，掙扎無力，排便干結(jié)且次數(shù)減少，偶有成硬球；②體溫先降低后升高。同時具備2個條件提示造模成功。造模成功后，非欲解時和欲解時大承氣湯組于每日5:00、17:00 予以大承氣湯2 mL·100 g-1灌胃，正常組和模型組灌等量蒸餾水，2 次/日。觀察大承氣湯組大鼠肛周污物明顯增加，瀉下稀溏樣便后分別在陽明病欲解時中心時（酉時）17:00-19:00隨機取欲解時模型組、大承氣湯組大鼠10 只，正常組大鼠9只，陽明病欲解時中心時對時（卯時）5:00-7:00隨機取非欲解時模型組、大承氣湯組大鼠10 只，正常組大鼠9只，剪斷大鼠頸部將其斷頭處死，將老鼠規(guī)定在鼠板上，逐層分離下腹部，截取小腸中段組織，預(yù)冷的生理鹽水漂洗干凈，注射器沖洗腸管內(nèi)部，稱取0.1 g 腸組織塊數(shù)段，收集于凍存管中，-80℃冰箱保存制備組織勻漿。連續(xù)取材5天。

1.2.4 效應(yīng)指標及檢測方法

標準品的稀釋、加樣與測定根據(jù)試劑使用說明書的要求，配置大鼠TNF-α 標準溶液，并在板孔內(nèi)稀釋為不同濃度梯度，復孔制作標準曲線。設(shè)空白和質(zhì)控復孔，空白孔加100μL 標準品稀釋液，余孔加大鼠組織勻漿100μL，酶標板覆膜，37℃溫育1 h。棄去液體甩干后每孔加檢測溶液A 工作液100 μL（臨用前配制），酶標板覆膜，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μL 的洗滌液洗滌，浸泡（1-2）min，重復洗板3次。每孔加檢測溶液B 工作液（臨用前配制）100μL，酶標板覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每孔加TMB 底物溶液90μL，酶標板覆膜，37℃避光顯色。每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度值。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，檢驗水準α= 0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

模型組、大承氣湯組大鼠給予12天熱藥灌胃后出現(xiàn)體質(zhì)量降低，豎毛，活動增加，飲水量增加，尿量減少、發(fā)黃；給予自身糞便混懸液后出現(xiàn)排便時間延長，大便干結(jié)，呈串珠、圓珠狀；腹腔注射脂多糖后，實驗大鼠進食量減少，行動遲慢，精神不佳，體質(zhì)量略有下降，排便次數(shù)減少，糞便干結(jié)，肛溫先降低后升高；大承氣湯組大鼠給予大承氣湯干預(yù)后精神狀態(tài)差，活動減少，抓取時反應(yīng)較快，呼吸較為急促，飲食飲水量有所增加，大小便次數(shù)增多，且肛周污物明顯增加或大便稀溏。

2.2 實驗大鼠各組TNF-α含量變化

結(jié)果顯示，模型組、大承氣湯組陽明病非欲解時第4 天TNF-α 表達高于正常組（P＜0.01），欲解時第1-3 天TNF-α 表達均高于正常組（P＜0.01）。欲解時大承氣湯組第3、4 天TNF-α 表達與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）。模型組欲解時第1、2、3 天TNFα 表達高于非欲解時（P＜0.01），大承氣湯組第1、3 天TNF-α表達高于非欲解時（P＜0.01），第4天低于非欲解時（P＜0.05）（表1、表2）。

表1 陽明病非欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

表1 陽明病非欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

注：同一天同一時點與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

時間第1天第2天第3天第4天第5天陽明病非欲解時（5-7時）正常組（N=9）129.79±0.218129.98±0.210129.56±0.056129.59±0.067130.13±0.146模型組（N=10）129.80±0.118129.97±0.138129.56±0.033129.88±0.120**130.15±0.260大承氣湯組（N=10）129.75±0.182130.10±0.082129.57±0.029129.94±0.254**130.07±0.301

表2 陽明病欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

表2 陽明病欲解時各組TNF-a比較（pg·mL-1,±s）

注：同一天同一時點與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；同一天同一時點與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；模型組同一天不同時點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；大承氣湯組同一天不同時點比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

時間第1天第2天第3天第4天第5天陽明病欲解時（17-19時）正常組（N=9）129.94±0.278129.98±0.232129.61±0.084129.89±0.243130.07±0.178模型組（N=10）130.23±0.292**△△130.32±0.115**△△129.87±0.158**△△130.00±0.192130.09±0.209大承氣湯組（N=10）130.42±0.172**▲▲130.24±0.221**130.24±0.232**＃?！?29.71±0.078＃?！?30.05±0.116

2.3 實驗大鼠各組TNF-α時間節(jié)律性變化

正常組TNF-α 表達與模型組、大承氣湯組相比呈低趨勢（P＜0.01）。模型組TNF-α 表達第2 天達到高峰，第3 天降至最低，之后趨于平穩(wěn)；欲解時TNF-α 表達高于非欲解時。大承氣湯組TNF-α 表達第1-3 天與模型組節(jié)律存在一致性，但其表達量高于模型組，第4 天明顯降低（P＜0.05），第5 天各組間趨于一致（圖1）。

圖1 實驗大鼠各組第1-5天TNF-a節(jié)律變化

3 討論

《素問·生氣通天論》曰：“故陽氣者，一日而主外。平旦人氣生，日中而陽氣隆，日西而陽氣已虛，氣門乃閉。”人與自然、天地相參，人體陽氣的盛衰變化、運行規(guī)律與一天內(nèi)陽氣變化大體一致。陽明之氣旺于申酉戌時（15:00-21:00），這段時間是太陽落山前后的6個小時，此時自然界中的陽氣逐漸衰退，借助逐漸衰退的陽氣，可使體內(nèi)之熱隨自然界陽衰而逐漸減退，故言陽明病于此時欲解。

陽明腑實證是多種急性腹部疾病中出現(xiàn)的一種證候，如急性闌尾炎、急性膽道感染、腸梗阻等，陽明腑實證能使腸道病變加重，嚴重時引起多器官功能衰竭等并發(fā)癥?，F(xiàn)代研究表明陽明腑實證的發(fā)生和內(nèi)毒素血癥密切相關(guān)。陽明腑實證由于宿食積滯、燥屎內(nèi)結(jié)，腸道內(nèi)大量積氣，腸道壓力明顯升高[9]，同時腸道菌群失調(diào)，腸道黏膜屏障受損，腸道通透性明顯升高，腸道內(nèi)革蘭陰性菌死亡后細胞壁崩解或活菌釋出內(nèi)毒素，釋放入血形成腸源性內(nèi)毒素血癥[10]。大量內(nèi)毒素（Endotoxin，ET）與細胞上的CD14 相結(jié)合，構(gòu)成LPS-CD14 受體，此受體作用于TLR4，進而激活LPSTLR4/NF-κB 信號通路，通過MyD88 蛋白轉(zhuǎn)導，激活NF-κB，NF-κB 進入細胞核，調(diào)控眾多炎性遞質(zhì)的基因表達，促進TNF-α、IL-1β等細胞因子的表達[11]。該病乃危重急癥，如不及時干預(yù)，釋放入血的諸多炎癥介質(zhì)進一步激活炎癥細胞通路，導致嚴重的組織損傷、功能破壞[12,13]，最終導致多器官功能障礙（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），甚至死亡。

TNF-α 是一類具有多種生物效應(yīng)的細胞因子，在信號傳導和介導T淋巴細胞增殖上發(fā)揮重要作用。研究表明，內(nèi)毒素與內(nèi)皮細胞、單核細胞等細胞膜上的受體相結(jié)合，激活核因子κB（NF-κB）信號通路，促進一氧化氮（Nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-a（Tumor necrosis factor，TNF-α）及白介素-1（Interleukin-1，IL-1）等大量炎性因子的分泌與釋放，誘發(fā)炎性級聯(lián)瀑布反應(yīng)，從而造成組織器官受損[14]。本實驗中，總體來看，模型組大鼠TNF-α 表達較空白組高（P＜0.01），因為大鼠機體免疫調(diào)節(jié)是動態(tài)過程，非欲解時模型組大鼠TNF-α 表達較低，隨后TNF-α 表達逐漸升高，至同一天欲解時模型組大鼠TNF-α 表達高于空白組（P＜0.01），說明體內(nèi)處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)。研究表明：TNFα 等細胞因子在受到LPS 或PHA 刺激后顯示晝夜波動，與刺激后的增殖反應(yīng)與淋巴細胞數(shù)相對應(yīng)，淋巴細胞DNA 合成的晝夜節(jié)律亦呈雙峰型，第1 個峰值出現(xiàn)在8:00-10:00 時，第2 個在20:00-24:00 時，谷值位于4:00 時[15]。這和本實驗TNF-α 表達的峰值、谷值相近?！秱摗分械牧?jīng)病“欲解時”簡單來說，就是在某個時刻，該經(jīng)正氣旺盛，抗邪更加有力。從中醫(yī)角度來看，TNF-α 作為炎性因子，是邪氣的一種表現(xiàn)，TNF-α 高表達可從側(cè)面說明機體正邪交爭之激烈，疾病可能相愈。本實驗TNF-α 陽明病欲解時與非欲解時的表達顯示出晝夜節(jié)律。尤在涇在《傷寒貫珠集》指出：“申酉戌時，日晡時也。陽明潮熱，發(fā)于日晡，陽明病解，亦于日晡。則申酉戌為陽明之時。其病者，邪氣于是發(fā)。其解者，正氣于是復也?！盵16]說明在陽明欲解時TNF-α 的高表達，既是由于細胞因子大量釋放，炎癥風暴的發(fā)生，造成機體損傷，使疾病迅速惡化的時期；但也是通過免疫功能的調(diào)動，有利于疾病康復的時間。同時在陽明腑實證5 天的觀察中發(fā)現(xiàn)，模型組TNF-α 表達在陽明病第1 天上升，第2 天達到峰值，72 h 達到最低值，之后趨于平穩(wěn)，這與許翠萍[17]等人研究相似，在疾病急性期時TNF-α釋放增加。

大承氣湯是《傷寒論》中治療陽明腑實證的代表方，由大黃、厚樸、枳實、芒硝四味藥組成，具有瀉下通里、竣下熱結(jié)的功效，主治大便不通、腹中轉(zhuǎn)矢氣、腹?jié)M疼痛、拒按、潮熱、手足截然汗出、脈遲有力。此時痞、滿、燥、實諸證具備，故以大承氣湯攻下。原文指出：“傷寒若吐若下后不解，不大便五六日，上至十余日，日晡所發(fā)潮熱，不惡寒，獨語如見鬼狀。若劇者，發(fā)則不識人，循衣摸床，惕而不安。微喘直視，脈弦者生，澀者死。微者，但發(fā)熱譫語者，大承氣湯主之?！毖芯勘砻?，具有下法的中藥能降低腸腔壓力，具有抗過氧化物損傷的作用，降低腸道內(nèi)壓力，改善腸壁循環(huán)，減輕過氧化物損傷，并對腸道屏障功能具有保護作用，有利于維持水、電解質(zhì)平衡[18]。君藥大黃可通過維持腸粘膜細胞的正常結(jié)構(gòu)、防止或修復腸粘膜萎縮及損傷、保護腸粘膜完整性[19-20]。大黃的瀉下作用和總蒽醌的成分有關(guān)，大黃蒽醌類成分是瀉下的有效成分[21]。芒硝、厚樸、枳實和大黃配伍，能顯著增加大黃中蒽醌類成分的溶出率[22]。芒硝的瀉下作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和與硫酸鈉密切相關(guān)[23]。芒硝所含的Na2SO 可使腸內(nèi)滲透壓升高，大量水分保留到腸腔，引起機械性刺激，導致排便。厚樸能緩解實驗大鼠胃腸動力障礙，促進小腸推進率[24]。厚樸的功效成分厚樸酚通過抑制氧化應(yīng)激減輕細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷（Acute lung injury，ALI），下調(diào)大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量[25]。下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 的磷酸化水平，下調(diào)NF-κB 信號通路中核因子κB 抑制因子α（IkBa）、p65 的磷酸化水平而有明顯的抗炎活性[26]。厚樸酚還有廣譜抗菌活性，對白色念珠菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有抑制作用[27]。枳實苦降，善，破氣除痞，消導積滯。四藥合用，具有強大的蕩滌腸道、峻下熱結(jié)的功效。

研究表明，大承氣湯具有減輕機體炎癥反應(yīng)的作用[28-30]。季永欣[31]等研究大承氣湯能有效防治急危重癥患者腸功能障礙并改善臨床預(yù)后，其機制可能與調(diào)節(jié)TLR/MyD88/NF-κB-p65 信號通路過度激活及其下游炎癥因子（IL-1β/IL-6/IL-8/TNF-α）有關(guān)。本實驗給予大承氣湯干預(yù)后，非欲解時組間差異不明顯（P＞0.05），第4 天藥物組TNF-α 仍高表達，猜測可能此時藥物瀉下作用發(fā)揮不充分或和動物免疫晝夜節(jié)律表達相關(guān)。整體上在非欲解時點，TNF-α 沒有較明顯下降趨勢（P＞0.05），第4 天仍是一個高表達狀態(tài)；欲解時藥物組前3 天TNF-α 升高，第3 天明顯高于模型組（P＜0.01），至第4 天明顯低于模型組（P＜0.01），第5天組間無差異。且藥物組1、3 天欲解時TNF-α 表達高于非欲解時（P＜0.01），第4 天低于非欲解時（P＜0.05），說明1-3 天處于疾病急性期，機體受LPS 刺激后增殖反應(yīng)加劇，盡管給予藥物干預(yù)，但此時邪氣較為旺盛，正邪交爭劇烈，故欲解時TNF-α 高表達且高于模型組，第4 天機體正氣勝邪，故TNF-α 表達下降，尤以欲解時明顯（P＜0.05），此時機體借助藥物及自然界陽氣變化而驅(qū)邪外出。本實驗給予大承氣湯干預(yù)后，欲解時組TNF-α表達總體上有下降趨勢。

綜上所述，大承氣湯可抑制下游炎性因子TNF-α表達，且在欲解時給藥效果顯著。陽明腑實證是一個臨床急性病，需要盡早干預(yù)。本實驗初探了對于陽明?。柮鞲瓕嵶C）的欲解時的時間治療學意義，利用陽明病欲解時的有效時機，給予合理藥物干預(yù)，能促使疾病向好的方向變化。本實驗選取了陽明病欲解時中心時酉時（17:00-19:00）及其對時卯時（5:00-7:00）兩時點進行研究，但陽明?。柮鞲瓕嵶C）欲解時本身是一個時間段，其他時點的探究需進一步挖掘。