基于Illumina Miseq分析黃精根腐病根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性＊

盧圣鄂，肖 波，任風(fēng)鳴，卓 維，黃紅燕

（重慶市藥物種植研究所 重慶 408435）

黃精（Polygonatum sibiricum）是百合科黃精族黃精屬（PolygonatumMill）多年生草本藥食兩用植物，《中國藥典》2020年版收錄的滇黃精（Polygonatum kingianumCol1. et Hemsl.）、黃 精（Polygonatum sibircumRed.）和 多 花 黃 精（Polygonatum cyrtonemaHua.），為其原生藥[1]。黃精含有豐富的對(duì)人體有益的化學(xué)成分[2，3]，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃精具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤燥之功效[4，5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃精還具有抗衰老、提高免疫力、調(diào)節(jié)造血能力、消炎、抗腫瘤和降血糖等多種功效[6，7]。黃精屬植物正處于野生變家種階段，但由于管理不當(dāng)，種植年限延長(zhǎng)，土壤微生物結(jié)構(gòu)變化等因素導(dǎo)致根腐病等多種病害逐年加重，嚴(yán)重影響到黃精根狀莖的產(chǎn)量和品質(zhì)。

真菌和細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致中藥材根腐病的發(fā)生[8]，植物的健康和營養(yǎng)情況與根際土壤的肥力和群落結(jié)構(gòu)組成有重要的關(guān)系[9,10]。但是，藥用植物根腐病還不能有效預(yù)防，通過對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性分析，對(duì)黃精根腐病的發(fā)生能有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。吳依婷[11]等研究了采集自湖南洪江根腐病黃精土壤，分離菌出了尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），而該菌常引發(fā)作物根腐病害。同時(shí)分離出了對(duì)黃精根腐病菌株具有較高的抗菌活性的內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。韓鳳[12]等研究確定尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌是引起多花黃精根腐病的病原菌。但是針對(duì)一種病原菌簡(jiǎn)單的分離和回接，并不足以深入了解黃精根腐病致病菌，高通量測(cè)序技術(shù)能夠有效迅速準(zhǔn)確測(cè)定真菌群落結(jié)構(gòu)。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被用來揭示三七連作障礙[9]，黃連[13]、西洋參[14]、蘋果根腐病[15]與根際土壤微生物組成及多樣性研究。因此本項(xiàng)目采用Novaseq-PE250 測(cè)序平臺(tái)對(duì)4年生黃精根腐病根際土壤（GG組）、4年生健康黃精根際土壤（GJ組）和未種過黃精的土壤（GK 組）真菌ITS1 序列進(jìn)行高通量測(cè)序，目的在于了解真菌群落與根腐病發(fā)生的關(guān)系，找到與根腐病發(fā)生相關(guān)的真菌類群，更有助于對(duì)黃精根腐病致病菌、致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品采集

土壤樣品采集自四川省廣安市鄰水縣壇同鎮(zhèn)蜀耕農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司黃精種植基地。海拔344 米，106°46'E，30°7'N，土壤類型為酸性紫色土，年降水量為1500 mm，年平均氣溫為16℃。樣品分為3 組：①4年生的根腐病黃精根際土壤采集3組樣品；②4年生的健康黃精根際土壤采集3 組樣品；③距離采集點(diǎn)約50 m 未種過黃精的土壤作為空白采集3 組樣品。黃精植株采集采用五點(diǎn)取樣法，取黃精根莖周圍3-5 mm 左右的土壤，待充分混勻后用無菌PET 樹脂袋封裝放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 土壤微生物總DNA提取和PCR擴(kuò)增

取土樣提取土壤總DNA，稱取0.5 g 土壤樣品，使用Fast DNA TMSPIN Kit for Soil（MP, USA）提取土壤總DNA，依據(jù)檢測(cè)DNA 樣品的濃度后，將DNA 稀釋到10 ng·μL-1，存于-80℃冰箱待用。使用ITS5F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）為引物對(duì)ITS1 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL（4 μL 5×Fastpfu Buffer，2μL 2.5 mM dNTP，0.8 μL 10 ng·μL-1引物ITS5F，0.8μL 10 ng·μL-1引物ITS1R，0.4 μL Fastpfu Polymerase，0.2 μL BSA，10 ng DNA）。擴(kuò)增后取3 μL 利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3 文庫制備與上機(jī)測(cè)序

采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫，使用Novaseq-P E250 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

圖1 患根腐病、健康根際土壤和空白土壤OUT數(shù)量關(guān)系

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0（New York，美國）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析采用單因素方差分析（ANOVA）。α多樣性分析，β多樣性分析采用QIIME（Version 1.7.0）軟件包進(jìn)行。物種的α 多樣性通過用Observed_species、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Chao1指數(shù)4 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行表征。在分類學(xué)層面，通過多種無監(jiān)督和有監(jiān)督的測(cè)序、聚類和建模方法，結(jié)合相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法，進(jìn)一步衡量不同樣本間物種豐富度組成的差異。用R 軟件（version 2.15.3）分析和生成稀釋度曲線、Venn 圖、相對(duì)豐度圖和50 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬的熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)和OTU聚類分析

本研究采用Novaseq-PE250 測(cè)序平臺(tái)對(duì)黃精病株、健株和空白土樣真菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析，通過對(duì)土壤中標(biāo)準(zhǔn)真菌ITS1 進(jìn)行測(cè)序，去除低質(zhì)量、Barcode 和引物序列后，9 個(gè)樣品得到有效序列總數(shù)為1063335 條，其中健株土樣有332391 條、病株土樣有399724 條、空白組土樣有331220 條。從韋恩圖（圖1）可以看出，黃精健株、病株和空白根際土壤真菌之間有共同的107 個(gè)OTUs，健康植株土樣有1109 個(gè)特有的OTUs，空白土樣有901 個(gè)特有的OTUs，而根腐病病株土壤僅有363個(gè)特有的OTUs。Venn圖的變化說明，根腐病導(dǎo)致了黃精根際土壤真菌OTUs 數(shù)的減少。從稀釋曲線（圖2）可以看出，數(shù)據(jù)曲線延展平緩合理，本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

2.2 土壤真菌α-多樣性分析

對(duì)黃精患根腐病株、健株根際和空白土壤真菌進(jìn)行α-多樣性分析表明（表1），種群多樣性指數(shù)（Shannon）根腐病株最低，健株其次，空白組最高，根腐病株與健株和空白組差異顯著；Simpson 指數(shù)根腐病株和健株相同，空白組最高；種群豐富度指數(shù)（Chao1和Observed_species）根腐病株最低，健株其次，空白組最高，且根腐病株與健株和空白組差異顯著（P＜0.05）。

表1 患根腐病、健康根際土壤和空白土壤真菌α-多樣性

2.3 不同分類水平上相對(duì)豐度分析

患根腐病、健康根際和空白土壤門分類水平中的主要優(yōu)勢(shì)菌群均為子囊菌門、擔(dān)子菌門、Zoopagomycota、毛霉門、壺菌門（圖3）。患病土樣中子囊菌門的相對(duì)豐度顯著高于健康土樣。健株、病株和空白根際土壤真菌組成差異較大，子囊菌門在根腐病根際土壤中為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度要顯著高于健康土樣和空白土樣，而毛霉門的相對(duì)豐度要顯著低于健康土樣和空白土樣（P＜0.05）。

圖2 稀釋曲線

圖3 根腐病、健康根際土壤和空白土壤真菌門組成柱形圖

在屬分類水平上（圖4），3組真菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度差別較大，已報(bào)道的與黃精根腐病相關(guān)的病原菌鐮刀菌屬（Fusarium）存在于所有樣品中，而有益菌木霉菌屬（Trichoderma）在健康土樣和空白土樣的相對(duì)豐度顯著高于患病土樣。藍(lán)狀菌屬（Talaromyces）在根腐病土壤中為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度要顯著高于健康土樣和空白土樣（P＜0.05）。

圖4 根腐病、健康根際土壤和空白土壤真菌門組成柱形圖

2.4 根際土壤真菌聚類分析

基于樣本距離矩陣做UPGMA 聚類分析，并將聚類結(jié)果與各樣品在門水平上的物種相對(duì)豐度整合展示在中（圖5），GG1、GG2 和GG3 這3 個(gè)病株樣本聚在一起，GK1 和GK2 這2 個(gè)空白樣本聚在一起，GJ1、GJ2、GJ3 和GK3 共3 個(gè)健康樣本和1 個(gè)空白樣本聚到一起，這種結(jié)果說明，黃精根腐病株與健株和空白樣本的根際土壤真菌存在明顯差異。

使用R 軟件，將屬水平的群落組成數(shù)據(jù)根據(jù)分類單元的豐度分布加以聚類，根據(jù)聚類結(jié)果對(duì)分類單元和樣品分別排序，并通過熱圖呈現(xiàn)（圖6）。豐度前50位的屬聚類熱圖，能夠更好的反映不同樣本中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。健康、空白、病株土壤微生物群落有較大差異，健株和空白微生物群落分布相對(duì)較為一致，群落結(jié)構(gòu)更為多樣，群落豐度更高。病株與健株和空白比較，且微生物群落結(jié)構(gòu)較為單一，群落豐度亦較低。

圖5 基于樣本距離矩陣的UPGMA聚類樹

從圖6可以看出，患根腐病株土樣中Exophiala（外瓶酶屬）、Knufia、Eurvularia、Meyerozyma、Apiotrichum、Papiliotrema、Vanrija、Aspergillus（ 曲 霉 屬） 、Oidiodendorn（樹粉孢屬）、Scytalidium（柱頂孢霉屬）、Talaromyces（籃狀屬）較健株土樣和空白土樣具有較高的物種相對(duì)豐度。

圖6 土壤真菌豐度前50的菌屬相對(duì)豐度Heatmap圖

而健康根際土樣和空白土樣中Nigrospora（黑孢屬）、Cutaneotrichosporon、Penicillium（青 霉 屬）、Penicillifer、Chaetomium（毛殼菌屬）、Humicola（腐質(zhì)霉屬）、Cladophialophora、Melanconiella（黑盤孢屬）、Neobulgaria（螺菌屬）、Metarhizium（綠僵菌屬）、Glutinomyces、Candida（假絲酵母屬）、Chaetosphaeria、Solicoccozyma、Ceratobasidium（角擔(dān)菌屬）、Mucor（毛霉屬）、Trichoderma（木霉菌屬）等相對(duì)豐度則高于病株土樣。

3 討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)能影響到土壤健康狀況，其變化影響到土壤健康的變化[16,17]。植物根際土壤被病原菌感染后會(huì)導(dǎo)致微生物結(jié)構(gòu)變化。真菌會(huì)分解植物的殘?bào)w和影響植物疾病的發(fā)生[9]。Xu[18]等發(fā)現(xiàn)根的健康狀況與真菌群落結(jié)構(gòu)之間存在著明確的關(guān)系。

通過對(duì)中藥材根腐病的研究證實(shí)，同種藥材在各個(gè)產(chǎn)地和各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)間里的病原菌都不相同[8]。只對(duì)單一病原菌的分離培養(yǎng)和回接，不能完整認(rèn)識(shí)導(dǎo)致黃精根腐病的病原菌，因此本項(xiàng)目采用高通量測(cè)序技術(shù)，目的在于了解認(rèn)識(shí)黃精根腐病與根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，更有助于對(duì)黃精根腐病致病菌、致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。

前人研究得出，植物土壤傳播病害的發(fā)生與土壤微生物多樣性的降低有很大的關(guān)系[19]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)豐富會(huì)壓制土壤病害的發(fā)生[20,21]。Wu[22]等研究發(fā)現(xiàn)，患根腐病的三七較健康三七的根際土壤微生物多樣性較低。本研究中黃精根腐病株、健株和空白組黃精根際土壤真菌進(jìn)行α-多樣性分析表明，種群多樣性指數(shù)（Shannon）根腐病株最低，健株其次，空白組最高，根腐病株與健株和空白組差異顯著，Simpson 指數(shù)根腐病株和健株相同，空白組最高，種群豐富度指數(shù)（Chao1和Observed_species）根腐病株最低，健株其次，空白組最高，且根腐病株與健株和空白組差異顯著。這與Wu[22]等的研究結(jié)果不一致，研究證實(shí)，三七健康植株根際土壤真菌豐度低于病株。余妙[14]研究顯示西洋參根腐病組真菌群落多樣性指數(shù)降低，真菌種類減少，達(dá)到最小。宋旭紅[13]研究證實(shí)，黃連根腐病株根際土壤群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)高于健康植株，種群豐富度指數(shù)則稍高于病株土樣。楊光柱[15]研究結(jié)果表明蘋果患根腐病土樣真菌多樣性指數(shù)和豐富度都高于健康組，均勻度指數(shù)低于健康組。

本研究中患病及健康根際土壤門分類水平中的主要優(yōu)勢(shì)菌群均為子囊菌門、擔(dān)子菌門、Zoopagomycota、毛霉門、壺菌門。患病土樣中子囊菌門的相對(duì)豐度顯著高于健康土樣。與前人對(duì)黃連[23]、三七[22]、柑橘[24]等的研究結(jié)果相一致，余妙等人[14]研究西洋參根腐病也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果。楊光柱[15]研究結(jié)果表明蘋果患根腐病土樣健康和患病土樣均觀察到子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門。對(duì)兩組樣本的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行差異性分析，并且健康土樣中子囊菌門的相對(duì)豐度顯著高于患病土樣。

中藥材根腐病被認(rèn)為是由鐮刀菌屬中的尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F.solani）導(dǎo)致的[8],并且發(fā)現(xiàn)石柱黃連根腐病的一種致病菌是腐皮鐮刀菌[25]。尖孢鐮刀菌造成歐盟等國的觀賞性植物枯萎、猝倒等，同時(shí)造成中藥材根腐病的發(fā)生[26-30]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)蘋果根腐病土壤中其相對(duì)豐度高于健康土壤。韓鳳[12]等研究確定尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌是引起多花黃精根腐病的病原菌。吳依婷[11]等研究從黃精根腐病株中分離得到的菌株為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。本研究在屬分類水平上，3組真菌群落結(jié)構(gòu)組成有較大差別，已報(bào)道的與黃精根腐病相關(guān)的病原菌鐮刀菌屬存在于所有樣品中，而有益菌木霉菌屬在健康土樣和空白土樣的相對(duì)豐度顯著高于患病土樣?；@狀菌屬在根腐病土壤中為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度要顯著高于健康土樣和空白土樣。

通過對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究，也能找到拮抗微生物存在的線索[31]。在生物防治中木霉菌屬因應(yīng)用潛力廣受矚目[27]，通過研究得出，木霉屬真菌在健康組和空白組中高于病株。其中M.anisopliae是一種被當(dāng)做微殺蟲劑使用的昆蟲病原真菌[32,33]。黃精及其他藥用植物生態(tài)化種植的順利開展需要利用好土壤中的優(yōu)質(zhì)拮抗真菌。

總之，黃精根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度的降低和具有致病性的真菌相對(duì)豐度的增加有可能導(dǎo)致了黃精根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變和根腐病的發(fā)生。通過高通量測(cè)序分析，能夠較好的去了解黃精根腐病組與健康組根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的差別，給黃精根腐病的解決提供新的思路。