小麥miR5062靶基因的鑒定及功能研究

劉 濤，吳保為，李志杰，劉振蘭，王 倩,2，趙惠賢,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642)

miRNA作為植物中一種重要的內(nèi)源小分子，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)在植株生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近二十多年來(lái)，植物體內(nèi)大量的miRNA被鑒定，而且對(duì)許多miRNA的調(diào)控機(jī)制也有深入的研究。如擬南芥miR160通過調(diào)控其靶基因ARF17參與了生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響植株胚胎和根的發(fā)育[1]。

小麥的miRNA研究起步較晚，但近些年相關(guān)的研究進(jìn)展迅速。小麥中大量的miRNA主要是通過小RNA測(cè)序方法在不同組織和發(fā)育階段及不同逆境脅迫下被鑒定出來(lái)。如本實(shí)驗(yàn)室在小麥旗葉和發(fā)育的籽粒中鑒定出24個(gè)已知的miRNA和55個(gè)新的miRNA[2]。截至2014年6月，小麥中119個(gè)miRNA已在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)里登記[3]。然而這些miRNA的靶基因及其在小麥生長(zhǎng)發(fā)育等方面的生物學(xué)功能基本上尚未鑒定。關(guān)于小麥中單個(gè)miRNA對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育作用的研究只有少量報(bào)道。過量表達(dá)tae-miR408或其靶基因TaTOC1被RNAi干擾均會(huì)引起小麥提前抽穗，而且tae-miR408通過調(diào)控其靶基因TaTOC1的表達(dá)影響植株高度和旗葉角度[4]。miR172通過調(diào)控Q等位基因在小麥穗部形態(tài)和谷物脫粒能力方面起到重要作用[5]。miR156通過調(diào)控靶基因SBP-Box轉(zhuǎn)錄因子來(lái)影響小麥株型[6]。小麥中的miR9678和TaMIR1139分別影響種子發(fā)芽、脫落酸或赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和磷饑餓響應(yīng)，但它們調(diào)控的靶基因尚未被鑒定出[7-8]。

ARGONAUTE(AGO)蛋白在生物界中的作用是十分廣泛又極其重要的。AGO蛋白與小RNA結(jié)合，共同維持基因組的穩(wěn)定，調(diào)控個(gè)體對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)以及在動(dòng)植物的各種發(fā)育事件中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默[9]。AGO基因廣泛存在于生物界，在許多不同的物種中都已鑒定出AGO基因的存在。不過在不同物種中AGO家族成員的數(shù)量具有一定的差異，如酵母只有1個(gè)AGO基因，果蠅含有5個(gè)AGO基因[10]，線蟲有27個(gè)AGO基因[11]，人類編碼8個(gè)AGO蛋白[12]。在開花植物中，擬南芥有10個(gè)AGO基因，水稻有19個(gè)AGO基因[13]，玉米有17 個(gè)AGO基因[14]。在植物中，有關(guān)擬南芥AGO家族的研究最多且最清楚；水稻和玉米的部分AGO家族成員的功能也有所揭示，如最近Zheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，OsAGO2在水稻花藥中通過在表觀遺傳學(xué)層次上調(diào)控OsHXK1的表達(dá)來(lái)控制活性氧化物的產(chǎn)生和絨氈層細(xì)胞程序性死亡的啟動(dòng)。然而關(guān)于小麥AGO家族的研究卻未見報(bào)道。此外，植物AGO基因是否作為miRNA的靶標(biāo)基因而受到調(diào)控也鮮有研究。

本課題組前期對(duì)小麥品種小偃6號(hào)的幼苗、旗葉和籽粒的3個(gè)發(fā)育時(shí)期(花后5 d、10 d和 20 d)的小分子RNA分別進(jìn)行高通量深度測(cè)序和分析，然后從在旗葉中偏愛性高表達(dá)的miRNA里選取了一個(gè)新的miRNA：tae-miR5062。tae-miR5062在小麥幼苗、旗葉和發(fā)育的籽粒中表達(dá)量高(分別為510、1 509和2 932 RPM)[2]。本研究在明晰tae-miR5062靶標(biāo)基因的基礎(chǔ)上，并進(jìn)一步探究tae-miR5062靶標(biāo)基因的基本性質(zhì)和生物學(xué)功能，以期揭示該基因在小麥生長(zhǎng)發(fā)育方面起的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

本研究所用小麥材料有小偃6號(hào)(采集苗期的根、莖、葉，二棱期的生長(zhǎng)點(diǎn)，抽穗期的穗部、旗葉，花后15 d的籽粒)和寧春16。擬南芥材料為哥倫比亞野生型(Columbia)。煙草材料為本氏煙草。

1.1.2 菌株和載體

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)轉(zhuǎn)化菌株GV3101、煙草瞬時(shí)表達(dá)載體pBI121及遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pCAMBIA1304由本實(shí)驗(yàn)室保存。亞細(xì)胞定位載體pGL3由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙天永教授惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑

KOD FX購(gòu)自TOYOBO公司(日本)；限制性內(nèi)切酶XbaI、BamHI、XhoI和NcoI、T4DNA連接酶、PrimeScript RT reagent Kit等購(gòu)自寶生物工程有限公司(大連)；高純總RNA快速抽提試劑盒購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒以及通用型DNA純化回收試劑盒均購(gòu)自TianGen生物公司(北京)；快速克隆技術(shù)試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物技術(shù)有限公司(南京)；DL2000 DNA Marker和250 bp DNA Marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司(北京)。所用PCR引物由西安擎科澤西生物有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1tae-miR5062的靶基因預(yù)測(cè)及克隆

利用本實(shí)驗(yàn)室前期未發(fā)表的降解組數(shù)據(jù)和patmatch軟件預(yù)測(cè)tae-miR5062的靶基因，通過參考IWGSC RefSeq v1.0的最新信息對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析，推測(cè)TraesCS2A01G419900.1及其在2B、2D染色體上同源基因?yàn)閠ae-miR5062的靶基因。利用DNAMAN軟件進(jìn)行miR5062與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)。采用ClustalX軟件將該基因與擬南芥、水稻的同源基因進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA5.0的鄰近法(neghhor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。根據(jù)靶基因編碼序列(coding sequence，CDS)設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：

TaAGO2-F：5′-ATGGATTACGAGCAAGG C-3′；

TaAGO2-R：5′-GATGAAGAACATGTTG TC-3′。

以寧春16各時(shí)期/部位的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：2×KOD buffer 25 μL, dNTPs(10 mmol·L-1)10 μL, KOD-FX 1 μL, 上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，寧春16 cDNA模板2 μL, 以ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR程序：95 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min 15 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段；將目的片段經(jīng)TA克隆后連接pMD19T載體；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性單克隆菌液送西安擎科澤西生物有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的即為靶基因克隆載體pMD19T-TaAGO2。

1.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體pBI121-pre-miR5062、pBI121-TaAGO2和pCA1304-TaAGO2及亞細(xì)胞定位載體pGL3-TaAGO2

根據(jù)miRBase(http://www.mirbase.org/)網(wǎng)站上公布的tae-miR5062的前體序列和表達(dá)載體pBI121，設(shè)計(jì)帶有XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)的引物，引物序列如下(下劃線指示酶切位點(diǎn))：

pre-miR5062-F：5′-CTAGTCTAGACAATT ATGTGCAAGTTAT-3′；

pre-miR5062-R：5′-CGCGGATCCACATGG TTCATATGCACT-3′。

根據(jù)靶基因TaAGO2的CDS和表達(dá)載體pBI121，設(shè)計(jì)帶有XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)的同源重組引物，引物序列如下(下劃線指示酶切位點(diǎn))：

TaAGO2-F：5′-GAGAACACGGGGGACTC TAGAATGGATTACGAGCAAGGCG-3′；

TaAGO2-R：5′-GGACTGACCACCCGGGG ATCCGATGAAGAACATGTTGTCC-3′。

根據(jù)靶基因TaAGO2的CDS和表達(dá)載體pCA1304設(shè)計(jì)帶有XbaI和NcoI酶切位點(diǎn)的引物，引物序列如下(下劃線指示酶切位點(diǎn))：

TaAGO2-F：5′-CTAGTCTAGAATGGATTACG AGCAAGGC-3′；

TaAGO2-R：5′-CATGCCATGGAGATGA AGAACATGTTGTC-3′。

根據(jù)靶基因TaAGO2的CDS和亞細(xì)胞定位載體pGL3設(shè)計(jì)帶有XhoI和NcoI酶切位點(diǎn)的引物，引物序列如下(下劃線指示酶切位點(diǎn))：

TaAGO2-F：5′-CCGCTCGAGATGGATTA CGAGCAAGGCGG-3′；

TaAGO2-R：5′-CATGCCATGGGATGAAG AACATGTTGTCCT-3′。

以寧春16 DNA為模板擴(kuò)增pre-miR5062序列。PCR體系：2×KOD buffer 25 μL, dNTPs(10 mmol·L-1)10 μL, KOD-FX 1 μL, 上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，寧春16 DNA模板2 μL, 以ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR程序：95 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 18 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段；用XbaI和BamHI分別將目的片段和pBI121載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后用T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性單克隆菌液送西安擎科澤西生物有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的即為pre-miR5062表達(dá)載體pBI121-pre-miR5062。

以質(zhì)粒pMD19T-TaAGO2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：2×KOD buffer 25 μL, dNTPs(10 mmol·L-1)10 μL, KOD-FX 1 μL, 上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板pMD19T-TaAGO2質(zhì)粒2 μL, 以ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR程序：95 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s， 68 ℃ 3 min 15 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段。

用XbaI和BamHI將pBI121載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后用同源重組法連接目的片段和線性化載體。連接體系：5×CEII Buffer 4 μL，Exnase II 2 μL，線性化載體5 μL，目的片段2 μL，以ddH2O補(bǔ)足至20 μL。連接反應(yīng)：37 ℃ 30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性單克隆菌液送西安擎科澤西生物有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的即為靶基因表達(dá)載體pBI121-TaAGO2。

用XbaI和NcoI分別將目的片段和pCA1304載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后用T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性單克隆菌液送西安擎科澤西生物有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的即為重組表達(dá)載體pCA1304-TaAGO2。

用XhoI和NcoI分別將目的片段和pGL3載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后用T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性單克隆菌液送西安擎科澤西生物有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的即為亞細(xì)胞定位載體pGL3-TaAGO2。

1.2.3tae-miR5062與靶基因的煙草瞬時(shí)表達(dá)互作驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pBI121-pre-miR5062和pBI121-TaAGO2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌落PCR鑒定后，將陽(yáng)性單克隆菌株置于搖床中，28 ℃、180 r·min-1過夜培養(yǎng)；經(jīng)4 ℃、3 000 r·min-1離心收集菌體，用乙酰丁香酮溶液重懸菌體并將OD600調(diào)至0.4，避光孵育2 h；按照?qǐng)D1在1月齡的煙草葉片上進(jìn)行注射；注射后將煙草置于適宜環(huán)境中繼續(xù)生長(zhǎng)，兩天后進(jìn)行GUS染色。

1.2.4 靶基因表達(dá)模式分析

為了檢測(cè)靶基因在小麥各時(shí)期/部位的表達(dá)量，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶基因定量引物，引物序列如下：

TaAGO2-qpcr-F：5′-CCAAGTACGTGCCT AGAATCCG-3′；

TaAGO2-qpcr-R：5′-AGCACATTGCCGTT CTTCGTCT-3′。

以actin基因作為內(nèi)參基因：

actin-qpcr-F：5′-AAATCTGGCATCACAC TTTCTAC-3′；

actin-qpcr-R：5′-GTCTCAAACATAATCT GGGTCATC-3′。

檢測(cè)小偃6號(hào)苗期的根、莖、葉，二棱期的生長(zhǎng)點(diǎn)，抽穗期的穗部、旗葉以及花后15 d的籽粒中TaAGO2基因的相對(duì)表達(dá)量。基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法采用2-△△Ct，每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.5 靶基因的亞細(xì)胞定位

根據(jù)Yang等[16]報(bào)道的方法進(jìn)行水稻原生質(zhì)體的制備。將C端連有GFP的重組質(zhì)粒pGL3-TaAGO2與原生質(zhì)體，按10 μL質(zhì)粒(5 μg)+100 μL細(xì)胞懸浮液+110 μL PEG依次加入到2 mL離心管中，橫放，避光，28 ℃靜置15 min。緩慢加入1 mL W5溶液洗滌，250 ×g離心10 min，收集細(xì)胞。用1 mL WI溶液懸浮細(xì)胞。避光， 28 ℃靜置培養(yǎng)約12 h。300 ×g離心10 min。將轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體置于0.1 μg·mL-1的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液中，避光靜置5 min。在460 nm熒光顯微鏡下觀察DAPI與DNA結(jié)合后的藍(lán)色熒光，在530 nm下觀察GFP的綠色熒光。從而確定TaAGO2在細(xì)胞中的位置。

1.2.6 靶基因過表達(dá)擬南芥制備及陽(yáng)性植株的篩選和鑒定

將重組表達(dá)載體pCA1304-TaAGO2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101；轉(zhuǎn)化成功后，采用蘸花法侵染擬南芥；通過在葉片噴施0.1% BASTA除草劑來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選。提取存活植株的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用引物TaAGO2-qpcr-F和TaAGO2-qpcr-R進(jìn)行PCR鑒定。選取10個(gè)以上陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)基因株系，用于以后的試驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 tae-miR5062的靶基因預(yù)測(cè)及篩選

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期未發(fā)表的降解組數(shù)據(jù)，利用patmatch軟件對(duì)tae-miR5062的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果共預(yù)測(cè)到5個(gè)靶基因(表1)。其中,TraesCS6D01G057600.1功能注釋為Photosystem II protein K；TraesCS5B01G451400.1和TraesCS5D01G192700.1是小麥不同染色體組上的同源基因，功能注釋為ARGONAUTE(AGO)MEL1蛋白；TraesCS2A01G419900.1和Traes CS2B01G439000.1同樣屬于同源基因，功能注釋為AGO2蛋白。

通過參考IWGSC RefSeq v1.0的最新信息對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析，排除掉不匹配和重復(fù)的結(jié)果后，選擇TraesCS2A01G419900.1及其在 2B、2D 染色體上同源基因作為tae-miR5062的靶基因。miRNA與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)顯示tae-miR5062作用于靶基因的編碼序列(圖2)。

2.2 tae-miR5062的靶基因的進(jìn)化分析

tae-miR5062的靶基因?qū)儆贏GO蛋白家族。通過與擬南芥和水稻AGO蛋白的進(jìn)化分析，該基因與OsAGO2親緣關(guān)系最近，與AtAGO2、AtAGO3、AtAGO7、OsAGO2、OsAGO3和OsAGO7同屬于AGO2/3/7進(jìn)化類群(圖3)，所以將TraesCS2A01G419900.1命名為TaAGO2。

2.3 重組表達(dá)載體pBI121- pre-miR5062、 pBI121- TaAGO2和pCA1304- TaAGO2以及亞細(xì)胞定位載體pGL3- TaAGO2構(gòu)建

將表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒和pre-miR5062的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖4A)。pre-miR5062大小為273 bp，菌落PCR下游引物長(zhǎng)度為載體插入位點(diǎn)下游180 bp，因此菌落PCR產(chǎn)物大小為453 bp。進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果顯示重組表達(dá)載體pBI121-pre-miR5062序列和讀碼框正確。

表1 tae-miR5062靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1 Predicted target genes for tae-miR5062

將表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后，與靶基因TaAGO2的PCR產(chǎn)物進(jìn)行同源重組連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖4B)。靶基因大小為3 150 bp。進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體pBI121-TaAGO2序列和讀碼框正確。

將表達(dá)載體pCAMBIA1304質(zhì)粒和靶基因TaAGO2的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和NcoI雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖4C)。進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體pCA1304-TaAGO2序列和讀碼框正確。

將亞細(xì)胞定位載體pGL3質(zhì)粒和靶基因TaAGO2的PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoI和NcoI雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖4D)。進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果顯示，重組載體pGL3-TaAGO2序列和讀碼框 正確。

2.4 tae-miR5062與其靶基因 TaAGO2互作的驗(yàn)證

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBI121-pre-miR5062和pBI121-TaAGO2分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，然后在煙草葉片上進(jìn)行分區(qū)注射。GUS染色結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的未連接GUS的pre-miR5062的農(nóng)桿菌注射區(qū)未染上色，另外轉(zhuǎn)化pBI121空載和轉(zhuǎn)化TaAGO2的農(nóng)桿菌的注射區(qū)能夠染上色且染色程度基本一致。但是共注射含有pre-miR5062和TaAGO2的區(qū)域的藍(lán)色明顯減弱(圖5)，說(shuō)明tae-miR5062與其靶基因TaAGO2互作降解，并降低了TaAGO2的表達(dá)。

2.5 TaAGO2表達(dá)模式分析

利用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)小麥不同組織中TaAGO2的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，TaAGO2在根中表達(dá)量很低，在葉中表達(dá)量也不高，但在旗葉、莖、穗和籽粒中都有較高的表達(dá)量，其中在生長(zhǎng)點(diǎn)(apical meristem，AM)中的表達(dá)量最高(圖6)。

2.6 TaAGO2的亞細(xì)胞定位

為了明確TaAGO2蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)部位，我們將C端連有GFP的TaAGO2融合表達(dá)載體pGL3-TaAGO2轉(zhuǎn)入水稻黃化苗葉鞘的原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。經(jīng)DAPI染色和熒光顯微鏡觀察顯示，TaAGO2蛋白的綠色熒光表達(dá)位置與細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)位置一致，說(shuō)明TaAGO2定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖7)。

2.7 過量表達(dá) TaAGO2基因?qū)M南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響

通過BASTA噴施，篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系至T1代(圖8)。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥TaAGO2基因表達(dá)水平顯著高于野生型(圖9)。通過T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株表型觀察，與野生型相比，過表達(dá)TaAGO2擬南芥并無(wú)明顯表型。

3 討 論

miRNA主要是通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tae-miR5062的靶基因是TaAGO2。小麥里已鑒定出的上百個(gè)miRNA中只有幾個(gè)miRNA的靶基因被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因此大量的小麥miRNA的靶基因需要鑒定。miRNA的靶基因首先通過生物信息學(xué)的軟件預(yù)測(cè)，如Target Finder、PatScan、miRU、psRNATarget等[17-19]。動(dòng)物和植物的miRNA作用機(jī)制有差異，因此須使用不同的預(yù)測(cè)軟件，如Target Finder用來(lái)預(yù)測(cè)動(dòng)物miRNA的靶基因。在植物中，psRNATarget用的比較多。但這些預(yù)測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)海量、假陽(yáng)性高和準(zhǔn)確性差等弊端。驗(yàn)證單個(gè)miRNA的靶基因方法主要有5′-RACE技術(shù)，而5′-RACE技術(shù)又存在成本高和操作難度大的缺點(diǎn)。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA和靶基因，該方法具有成本低、難度小和時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，為驗(yàn)證小麥miRNA與其靶基因互作提供簡(jiǎn)便快速方法，有助于小麥大量miRNA靶基因的鑒定。例如，Wang等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)體系和熒光定量分析證明了tae-miR164對(duì)TaMAPF4的調(diào)控。

據(jù)報(bào)道，水稻OsAGO2調(diào)控花藥的發(fā)育[15]。過量表達(dá)OsAGO1b引起水稻葉片正面內(nèi)卷，而且分蘗數(shù)降低；RNAi介導(dǎo)的OsAGO1b降低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株葉片未見明顯表型，但花藥異常且花粉育性降低，導(dǎo)致種子減少[21]。水稻中過量表達(dá)OsAGO17能增加籽粒大小和粒重，且促進(jìn)莖部發(fā)育[22]。但我們發(fā)現(xiàn)TaAGO2在擬南芥中過量表達(dá)時(shí)植株在生長(zhǎng)發(fā)育方面并未見明顯的表型。例如，TaAGO2在生長(zhǎng)點(diǎn)、旗葉和籽粒中高表達(dá)，轉(zhuǎn)基因后代在生殖生長(zhǎng)及角果數(shù)等方面與野生型相比沒有明顯的差異。這可能是由于物種間的差異，小麥的TaAGO2在擬南芥中過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的表型與已報(bào)道的AGO家族成員過量表達(dá)或低表達(dá)的突變體的表型不同。另外，AGO蛋白大家族在生物界中的作用是十分廣泛又極其重要的，但植物AGO蛋白轉(zhuǎn)錄后水平被miRNA調(diào)控未見報(bào)道。本研究首次揭示小麥的TaAGO2是tae-miR5062的靶基因。

TaAGO2在小麥根中表達(dá)量很低，在葉中表達(dá)量也不高，但在旗葉、莖、穗、籽粒和生長(zhǎng)點(diǎn)中都有較高的表達(dá)量，其在旗葉和籽粒中的表達(dá)量相當(dāng)。tae-miR5062在小麥旗葉和籽粒中都高表達(dá)，表達(dá)量分別為1 509和2 932 RPM[2]，即籽粒中的表達(dá)比旗葉中的高約一倍，這與靶基因TaAGO2在該組織中的表達(dá)模式并不完全一致。同一miRNA可能調(diào)控多種不同類型的基因的表達(dá)，而同一個(gè)基因也有可能受多個(gè)miRNA的調(diào)控[23-24]。tae-miR5062另外一個(gè)可信度較高的靶基因還有AGO MEL1，這可能是導(dǎo)致tae-miR5062和靶基因TaAGO2在小麥各組織中的表達(dá)沒有完全對(duì)應(yīng)的原因之一。

培育轉(zhuǎn)基因小麥具有難度大、花費(fèi)高和時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)節(jié)省時(shí)間，但花費(fèi)高，操作難度大，且表型不明顯。轉(zhuǎn)入擬南芥進(jìn)行表達(dá)則簡(jiǎn)單、花費(fèi)低且時(shí)間短。因此，將小麥中感興趣的基因首先轉(zhuǎn)到擬南芥中觀察植株表型，若有明顯的、值得深入研究的表型，再將其轉(zhuǎn)入小麥中進(jìn)行深入分析是研究小麥基因的的首選方案。本研究結(jié)果為深入探究TaAGO2在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能提功了基礎(chǔ)信息。

4 結(jié) 論

本研究在小麥(Triticumaestivum)中新發(fā)現(xiàn)了幼苗、旗葉和發(fā)育籽粒中高表達(dá)的tae-miR5062，利用生物信息學(xué)方法確定TaAGO2為其靶基因，進(jìn)一步構(gòu)建tae-miR5062前體和TaAGO2的重組表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。結(jié)果表明,tae-miR5062與其靶基因TaAGO2互作。TaAGO2在根和葉中表達(dá)量不高，但在旗葉、莖、穗、籽粒和生長(zhǎng)點(diǎn)中都有較高的表達(dá)量。TaAGO2蛋白被定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；在擬南芥過量表達(dá)TaAGO2轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面無(wú)明顯的表型。