時實熒光定性PCR 實驗室內(nèi)質(zhì)控方法的建立及探討

字立源，蘭曉燕，黃蘇金，楊婧涓，陳桂余，胡付娟，尹瀟，朱碧姝，李維錦，謝函凌，楊雪，朱榮華保山市中心血站檢驗科辦公室，云南保山 678000

目前， 實時熒光定量PCR 已廣泛應(yīng)用于疾病臨床診療和醫(yī)學(xué)研究，如用于抗病毒藥物治療監(jiān)測的外周血病毒含量測定，基因表達(dá)等方面。中國在2015 年底在無償獻(xiàn)血者中全面開展了核酸檢測，有效縮短窗口期，大大降低了輸血傳播病原體的風(fēng)險[1]。核酸檢測室內(nèi)質(zhì)量控制對于保證NAT 結(jié)果的可靠性具有重要意義， 然而目前尚未能建立統(tǒng)一的NAT 質(zhì)量控制方法?！堆竞怂釞z測實驗質(zhì)量保證指南》中提到血站核酸測室內(nèi)質(zhì)控的基本要求：每一批檢測應(yīng)至少有一個弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品。該實驗室結(jié)合檢測系統(tǒng)的混樣方式及檢測下限，CT 值（實時監(jiān)測擴增過程的熒光信號達(dá)到指數(shù)擴增時的循環(huán)周期數(shù)）與原始擴增模板數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，可通過其與原始模板的函數(shù)關(guān)系，來計算原始模板的數(shù)量，評價該實驗室室內(nèi)質(zhì)控模式的可行性，監(jiān)控室內(nèi)質(zhì)控體系的運行情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑： 質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用北京康切斯特批號201706005， 試劑盒為蘇州華益美公司， 批號MA20171209，MA20180604 兩個試劑批號。 儀器：全自動核酸提取儀（HAMILTON STAR）；ABI 7500 熒光擴增儀（美國ABI 公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度的選擇

標(biāo)準(zhǔn)品濃度的選擇原則覆蓋高中低濃度值，室內(nèi)質(zhì)控濃度應(yīng)盡可能接近試劑與系統(tǒng)最低檢測限，檢測用于檢測限濃度的質(zhì)控品檢測的穩(wěn)定性較差[2]。 根據(jù)最低檢測限，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作選擇相應(yīng)濃度值。

1.3 質(zhì)控圖的繪制

連續(xù)測定20 次質(zhì)控數(shù)值，計算其均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），以X 為中心線，以質(zhì)控值超過X±2S 為警告限， 超過X±3S 為失控限，作圖建立一個質(zhì)控框架[3]。

1.4 實驗有效性判斷

試劑盒提供的陰性質(zhì)控品對照陰性、陽性質(zhì)控品對照陽性、內(nèi)標(biāo)的CT 有效值≤40；外部質(zhì)控值超過（X±2S）為警告限， 超過（X±3S）為失控限。 同時，以Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法進(jìn)行輔助判斷，10 個質(zhì)控值均落在均值一側(cè)，判定為失控。

1.5 統(tǒng)計方法

用Excel 表格繪制質(zhì)控圖，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（IU/mL）與CT 值

理論濃度與檢測CT 值結(jié)果見表1。

表1 配制理論濃度與檢測CT 值

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度與CT 值在0.05 水平呈高度負(fù)相關(guān)

HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 與CT 值的相關(guān)系數(shù)分別為（r=-0.873，-0.966，-0.797）。 CT 值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的函數(shù)關(guān)系依次為Y=-0.0236X+39.16，R2=0.762；Y=-0.0122X+41.452.16，R2=0.934；Y=-0.0016X+40.913，R2=0.635。

2.3 結(jié)果正態(tài)性檢驗

對2 個批次試劑119 次實驗質(zhì)控CT 值以及通過相關(guān)函數(shù)計算濃度值進(jìn)行正態(tài)性檢驗，試劑批號為MA20171209 的73 次實驗CT 值通過相關(guān)函數(shù)計算濃度值均服從正態(tài)分布（P＞0.05）；試劑批號為MA20180604 的46 次實驗CT 值及通過相關(guān)函數(shù)計算濃度值均服從正態(tài)分布（P＞0.05），見表2、3。

表2 質(zhì)控品CT 值正態(tài)性檢驗

表3 質(zhì)控品CT 值與對應(yīng)函數(shù)關(guān)系計算濃度正態(tài)性檢驗

2.4 用“即刻法”進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控情況

用HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 的濃度值進(jìn)行前20 次實驗的質(zhì)量控制， 只有HBV-DNA 能完成20 次的控制過程均為在控狀態(tài)，HCV-RNA 和HIV-RNA 在未能到20 次，均有失控狀態(tài)發(fā)生。

2.5 Levey-Jennings 質(zhì)控圖的建立

用CT 值與質(zhì)控品濃度之間的函數(shù)關(guān)系分別計算HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 的濃度值，計算結(jié)果經(jīng)過正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布，說明可以采用L-J 質(zhì)控圖及相應(yīng)的質(zhì)控規(guī)則進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。 HBVDNA 前20 次采用即刻法，剔出離群值，計算前20 次均值（X），標(biāo)準(zhǔn)差（S），建立L-J 室內(nèi)質(zhì)控框架，從第21 次開始用L-J 質(zhì)控。 HCV-RNA、HIV-RNA 采用預(yù)設(shè)固定框架法：即在更換試劑或質(zhì)控品批號時，以上一批號濃度值均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）建立框架。

3 討論

CT 值是當(dāng)前實時熒光PCR 的主要定量參數(shù)。 它是實時PCR 的基本參數(shù)， 也是獲得準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。 起始模板量越多，熒光信號在統(tǒng)計學(xué)上顯著高于背景信號所需的PCR 循環(huán)數(shù)越少， 反之則越多。 基于PCR 原理的檢測方法可以用循環(huán)閾值（CT 值）作為檢測值做質(zhì)控圖[4]。

但是直接利用CT 值原始數(shù)值作“即刻法或Levey-Jennings 圖”室內(nèi)質(zhì)控，很難滿足條件。 缺點有:①CT 值越小，起始濃度拷貝數(shù)越大；CT 值越大，起始濃度拷貝數(shù)越?。凰越⒌馁|(zhì)控圖不夠直觀,高值失控在L-J 質(zhì)控圖上表現(xiàn)為低值失控， 實際結(jié)果剛好相反；②因采用的是PCR 定性實驗, CT 值的不精確度(CV)很小,容易造成假失控,在實際室內(nèi)質(zhì)控工作中很難實現(xiàn)，達(dá)不到監(jiān)控核酸實驗有效性的目的。

在實時熒光PCR 中，每個模板的CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系， 起始拷貝數(shù)越多，CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的外部標(biāo)準(zhǔn)品可做出校正曲線。 因此，只要獲得未知標(biāo)本的CT 值，即可從校正曲線上計算出該標(biāo)本的起始拷貝數(shù)，這是采用外標(biāo)進(jìn)行實時熒光PCR 絕對定量的基本原理[5]。筆者實驗室證實，室內(nèi)質(zhì)控品濃度與CT 值在0.05 水平呈高度負(fù)相關(guān)，HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 與CT 值的相關(guān)系數(shù)為（r=-0.873，-0.966，-0.797）。 根據(jù)相應(yīng)檢測項目的回歸方程，計算出相應(yīng)檢測項目外部質(zhì)控品的濃度值。 這就是我們利用CT 值來定量起始拷貝數(shù)比用PCR 反應(yīng)終點時所測得的PCR 產(chǎn)物量推斷的起始拷貝更可信的主要原因。趙航等[5]人用CT值與RNA 標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)建立回歸曲線， 證明用此方法可以定量檢測相應(yīng)病毒。

PCR 擴增產(chǎn)物呈指數(shù)增長， 擴增過程中， 影響PCR 反應(yīng)的因素較多，稍有不同就可能會導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生較大的變化。建立該實驗室可行的核酸標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制方法是實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠的有力保障。 HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA 濃度值與CT 值呈負(fù)相關(guān)，利用回歸方程計算值，將檢測CT 值轉(zhuǎn)換為濃度值，再建立質(zhì)控框架，所得數(shù)據(jù)直觀，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。CT 值利用回歸方程計算濃度值經(jīng)過正態(tài)性檢驗，均服從正態(tài)分布， 可以采用Levey-Jennings 作質(zhì)控圖。筆者在更換試劑批號或質(zhì)控品批號前20 次實驗采用即刻法， 只有HBV-DNA 能完成20 次的控制過程均為在控狀態(tài)，HCV-RNA 和HIV-RNA 在未能到20次， 均有失控狀態(tài)發(fā)生。 原因主要是DNA 標(biāo)準(zhǔn)品與RNA 標(biāo)準(zhǔn)品相比，DNA 有相對較好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和敏感性。 所以即刻法在本實驗室只適用于HBVDNA 的前20 次實驗的控制， 而HCV-RNA 和HIVRNA 不適用即刻法。 HCV-RNA 和HIV-RNA 前20次實驗采用預(yù)設(shè)固定框架（上一批號的均值和標(biāo)準(zhǔn)差），第21 次實驗以前20 次實驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立質(zhì)控框架。 根據(jù)檢測前20 個點結(jié)果計算HBV-DNA 的CV值 為17.92%，HCV-RNA 的CV 值 為30.77%，HIVRNA 的CV 值為23.82%。按照國家標(biāo)準(zhǔn)，酶免法的反應(yīng)板內(nèi)CV≤15%， 而常規(guī)IQC 的CV 可以達(dá)到30%左右[6]。所以根據(jù)此方法建立的質(zhì)控框架有效。該實驗室的質(zhì)控規(guī)則定為以質(zhì)控值超過（X±2S）為警告限，超過（X±3S）為失控限，質(zhì)控值10 個點在均值一側(cè)為失控。 從HBV-DNA 質(zhì)控圖可以看出，L-J 質(zhì)控圖上有4 次警告，提示有隨機誤差。HCV-RNA 質(zhì)控圖有1次失控，10 個質(zhì)控值均落在均值一側(cè)，提示可能存在系統(tǒng)誤差。需要采取糾正和預(yù)防措施改進(jìn)實驗室的檢驗質(zhì)量[7-8]。

由于數(shù)據(jù)的有限， 今后加大對檢測數(shù)據(jù)的驗證。該方法也有一定的局限性， 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是關(guān)鍵。有好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，是檢驗結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。