球等鞭金藻的異養(yǎng)培養(yǎng)

（煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，金藻、硅藻等微藻不僅可作為水產(chǎn)動物開口飼料或幼魚餌料，還可凈化水體，吸收銨鹽等物質(zhì)，對銨氮及亞硝酸鹽的硝化有促進作用[1]。目前，微藻的大規(guī)模商業(yè)化培養(yǎng)主要在光生物反應(yīng)器和戶外開放性培養(yǎng)中進行。光生物反應(yīng)器有占地面積大、生產(chǎn)周期長、藻類生長密度較低等缺陷，生產(chǎn)成本較高；戶外開放培養(yǎng)有產(chǎn)量低、質(zhì)量低、CO2補加困難、收獲成本高、易被其他生物污染、對水質(zhì)要求過高等問題，限制了微藻的應(yīng)用及發(fā)展[2]。

金藻（Isochrysis）體積小，繁殖快，營養(yǎng)豐富，在水產(chǎn)動物魚苗中有重要作用。球等鞭金藻 (Isochrysis galbanaParke 3011) 是水產(chǎn)育苗中常用餌料生物，有細胞膜薄、無細胞壁、蛋白質(zhì)含量高、易被魚蝦蟹貝類消化吸收的特點，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟動物生產(chǎn)[3]。在生物反應(yīng)器中異養(yǎng)培養(yǎng)球等鞭金藻，則金藻可利用加入的有機碳源、氮源進行細胞生長繁殖，生產(chǎn)有用物質(zhì)。異養(yǎng)培養(yǎng)可克服金藻戶外開放式養(yǎng)殖和光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的諸多缺陷，有微藻生長速度更快、可實現(xiàn)純種培養(yǎng)、單位體積產(chǎn)率高、便于自動化控制等優(yōu)勢[4]。目前，以小球藻、硅藻等異養(yǎng)研究居多，對金藻異養(yǎng)的研究主要集中在碳源篩選和不同培養(yǎng)方式的對比，楊靜等[5]在外加碳源異養(yǎng)及不同培養(yǎng)方式下，篩選出球等鞭金藻適合異養(yǎng)；Yousef A等[6]比較自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)等鞭金藻更適合混合培養(yǎng)。張帆[7-8]對球等鞭金藻 (Isochrysis galbanaCCMM5001) 進行避光異養(yǎng)培養(yǎng)15 d，其細胞密度為7.24×106mL-1，僅為自養(yǎng)培養(yǎng)的1.08倍，其研究主要利用微藻獲得高附加值，并未關(guān)注異養(yǎng)培養(yǎng)如何獲得高生物量的活體金藻。為獲取高密度的金藻，縮短培養(yǎng)時間，實現(xiàn)純種化培養(yǎng)，本課題組通過避光異養(yǎng)培養(yǎng)球等鞭金藻，篩選異養(yǎng)培養(yǎng)基[3]。筆者進一步研究碳氮源種類及濃度對異養(yǎng)培養(yǎng)等鞭金藻3011的影響，為微藻大規(guī)模異養(yǎng)培養(yǎng)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

球等鞭金藻3011，由中國海洋大學微藻種質(zhì)庫（MACC）提供。

1.2 金藻培養(yǎng)

自養(yǎng)培養(yǎng)：在500 mL三角瓶中加入200 mL f/2培養(yǎng)基，接種50 mL金藻種子液，放入光照培養(yǎng)箱中，以24 ℃、160 r/min條件培養(yǎng)2周。

異養(yǎng)培養(yǎng)：以KS(G)異養(yǎng)培養(yǎng)基[8]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，海水配制：每升海水中加入葡萄糖10.0 g，NaNO31.0 g，NaH2PO40.12 g，Na2SiO30.2 g，微量元素Na2EDTA 10 mg、H3BO310 mg、MnCl22.0 mg、CuSO40.1 mg、CoCl20.05 mg、FeCl310 mg、ZnSO40.1 mg。所配制培養(yǎng)基用0.5 mol氫氧化鈉溶液pH調(diào)整為7.0，于121 ℃下滅菌30 min，冷卻后加入維生素B120.05 mg/L，備用。在500 mL三角瓶中加入200 mL滅菌異養(yǎng)培養(yǎng)基，接種50 mL金藻種子液，放入MQD-B3R培養(yǎng)箱（上海楓岳商貿(mào)有限公司）中以30 ℃、160 r/min避光培養(yǎng)，當藻細胞生長進入平穩(wěn)期或一周后停止實驗，每12 h取樣測定微藻生物量。

1.3 碳源異養(yǎng)培養(yǎng)實驗

分別以10.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、甘油、乙酸鈉、淀粉、乙醇，以及10 g/L葡萄糖、9.5 g/L蔗糖、10.22 g/L甘油、13.67 g/L乙酸鈉、9 g/L淀粉、7.67 g/L乙醇（碳元素濃度0.333 mol/L）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，進行等碳源濃度及等碳元素濃度兩個實驗，均以不加碳源的培養(yǎng)基為對照，在1.2的條件下進行微藻培養(yǎng)，每個實驗組均設(shè)置3個平行組，考察不同碳源種類及碳源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響。

1.4 氮源異養(yǎng)培養(yǎng)實驗

分別以1.0 g/L的NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、酵母浸粉、胰蛋白胨，以及1.0 g/L NaNO3、0.47 g/L NH4NO3、0.63 g/L NH4Cl、0.78 g/L(NH4)2SO4、0.35 g/L尿素、1.37 g/L、酵母浸粉、1.17 g/L胰蛋白胨為氮源，進行等氮源濃度及等氮元素濃度兩個實驗，均以不加氮源的培養(yǎng)基為對照，在1.2的條件下進行微藻培養(yǎng)，每個實驗組均設(shè)置3個平行組，考察不同氮源種類及氮源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響。

1.5 磷源異養(yǎng)培養(yǎng)實驗

按照磷元素相等的原則，分別以0.12 g/L NaH2PO4、0.142 g/L Na2HPO4、0.136 g/L KH2PO4作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的磷源，以不加磷源的培養(yǎng)基為對照，在1.2的條件下進行微藻培養(yǎng)，每個實驗組均設(shè)置3個平行組，考察不同磷源種類及磷源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響。

1.6 異養(yǎng)培養(yǎng)金藻生物量測定

將藻液稀釋成濃度梯度，在680 nm處測其光密度（OD）值，同時用血細胞計數(shù)板計數(shù)（用乙醇或甲醛將藻固定，至少計數(shù)3次）。以O(shè)D值為橫坐標，細胞密度（104mL-1或105mL-1）為縱坐標作圖，建立細胞密度與光吸收值曲線。每天同一時間段搖勻并吸取藻液5 mL，測定OD值，如濃度過大，需稀釋測定，根據(jù)細胞密度與光密度曲線，換算細胞密度。

比生長速率μ計算：

式中，Nt，td時的細胞數(shù)量；N0，初始細胞數(shù)量；t，培養(yǎng)時間。

采用干質(zhì)量法[9]測定微藻生物量。取藻液于8000 r/min下離心6 min，棄上清，加蒸餾水洗滌，離心，重復兩次，移藻泥至表面皿，涂勻，于-40 ℃冰箱預凍。冷凍真空干燥12 h，取出稱質(zhì)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS20.0 分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標準差表示，并作單因素方差分析和Duncan多重比較，P＜ 0.05 時差異有統(tǒng)計學意義，使用Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，球等鞭金藻的自養(yǎng)培養(yǎng)藻液呈金黃色（圖1），異養(yǎng)培養(yǎng)藻液呈白色，藻細胞較小，自養(yǎng)條件下微藻細胞直徑為4.5～5.0 μm，異養(yǎng)條件下僅為2.0～3.0 μm，且微藻活動性減弱。

圖1 自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的球等鞭金藻Fig.1 Isochrysis glalban under autotrophic and heterotroph

2.1 碳源對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響

2.1.1碳源種類對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響 圖2可見，與對照組相比，不同實驗組金藻多在培養(yǎng)36～48 h左右進入對數(shù)生長期，不同碳源條件下，球等鞭金藻生長表現(xiàn)不同，以甘油和乙醇為碳源時，培養(yǎng)過程中金藻生物量基本未增加，不適合作為異養(yǎng)碳源；乙酸鈉為碳源時，金藻生物量增長緩慢。以淀粉、葡萄糖和蔗糖為碳源時，金藻生物量增長明顯。

在同碳源濃度實驗中，培養(yǎng)96 h后，除葡萄糖組仍處生長期外，各組均進入平穩(wěn)期，因此提前結(jié)束實驗。圖2（1）可見，淀粉對金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的促進作用顯著低于葡萄糖和蔗糖，培養(yǎng)72 h，淀粉組金藻密度為1.3×109mL-1，低于葡萄糖組的2.4×109mL-1，而蔗糖組培養(yǎng)60 h藻細胞濃度即達到2.2×109mL-1，之后生物量逐漸降低。以葡萄糖為碳源，培養(yǎng)96 h時，藻細胞密度達到3.8×109mL-1。同碳元素濃度組實驗表明，葡萄糖對金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的促進作用最佳，培養(yǎng)96 h，藻細胞密度即達到7.19×108mL-1，蔗糖次之（P＜ 0.05）。兩組實驗均表明，異養(yǎng)條件下葡萄糖更易被異養(yǎng)的球等鞭金藻吸收利用，即葡萄糖為微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的最佳碳源。

圖2 碳源種類對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Fig.2 Effect of carbon source types on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.1.2碳源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響 葡萄糖濃度對金藻生長的影響見圖3。金藻異養(yǎng)培養(yǎng)到42 h進入對數(shù)生長期，之后藻細胞濃度隨葡萄碳質(zhì)量濃度的升高而逐漸升高，在40 g/L時到達拐點，之后開始逐漸下降。葡萄糖質(zhì)量濃度為10、20 g/L時，金藻生長較緩慢，培養(yǎng)96 h時，葡萄糖質(zhì)量濃度為40、50、60、70 g/L 四組藻細胞密度均在5×109mL-1左右，無顯著差異（P＞ 0.05），培養(yǎng)到144 h時，各組有明顯差異（P＜ 0.05），其葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時，達到1.2×1010mL-1，測得生物量為22.16 g/L，為金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的最適葡萄糖濃度。

圖3 葡萄糖濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.2 氮源對球等鞭金藻異養(yǎng)的影響

2.2.1氮源種類對球等鞭金藻異養(yǎng)的影響 在同氮源濃度實驗中，98 h后除尿素組仍處生長期外，各組均進入平穩(wěn)期，因此提前結(jié)束實驗。圖4可見，與對照組相比，不同氮源對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)均有不同程度的促進作用，以NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母浸粉、胰蛋白胨為氮源，金藻生長緩慢，藻細胞密度較低。圖4（1）中，尿素組與其他實驗組在98 h時均有顯著性差異 (P＜ 0.05)。以尿素和NaNO3作為氮源，培養(yǎng)前80 h藻細胞密度相差不大，比生長速率相近，分別為4.72%和4.47%，培養(yǎng)至98 h尿素組微藻密度達9.6×109mL-1（生物量為18.35 g/L），高于NaNO3組的7.1×109mL-1。

同氮元素濃度組實驗表明，NH4NO3作為氮源對金藻異養(yǎng)培養(yǎng)有一定促進作用，前120 h胰蛋白胨、NaNO3和尿素組微藻的生長狀況相近，120 h后尿素組微藻生物量高于NaNO3和胰蛋白胨組，在144 h分別達2.2×1010、1.79×1010、1.48×1010mL-1，生物量分別為38.56、31.87、26.84 g/L；因此，尿素是球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的最適氮源。此外，金藻快速繁殖時大量消耗氮源，有機氮源中，尿素含氮量最高且價格便宜，是金藻異養(yǎng)培養(yǎng)合適選擇[10]。

2.2.2氮源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)的影響 以40 g/L葡萄糖作為碳源，不同尿素濃度下微藻的生長情況見圖5。藻細胞密度隨時間增加而增加，培養(yǎng)98 h時藻細胞密度達7.0×109mL-1左右。98 h后，尿素質(zhì)量濃度為0.2 g/L組，由于氮源耗盡，金藻密度有所下降。其他濃度組，以質(zhì)量濃度1.0 g/L組生長最佳，培養(yǎng)98 h時藻細胞密度可達9.7×109mL-1，170 h可達1.8×1010mL-1，測得生物量為22.16 g/L。

圖4 氮源種類對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Fig.4 Effect of nitrogen source types on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

圖5 尿素濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Fig.5 Effect of urea concentration on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.3 磷源對球等鞭金藻異養(yǎng)的影響

2.3.1磷源種類對球等鞭金藻異養(yǎng)的影響 以40 g/L葡萄糖為碳源、1.0 g/L 尿素為氮源進行微藻異養(yǎng)培養(yǎng)，不同磷源下的金藻生長狀況見圖6。與對照相比，3種磷源均對金藻異養(yǎng)有不同程度促進作用，在96 h達到平穩(wěn)期。KH2PO4組藻細胞密度分別與Na2HPO4組和NaH2PO4組存在顯著性差異（P＜ 0.05）。培養(yǎng)96 h 時，KH2PO4組藻細胞密度達2.13×1010mL-1，測得生物量為37.42 g/L。之后各組進入平穩(wěn)期，藻細胞密度逐漸下降，在144 h，KH2PO4和NaH2PO4組藻細胞密度均在6.7×109mL-1左右，無顯著差異（P＞ 0.05）。

圖6 磷元素濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Fig.6 Effect of phosphorus concentration on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.3.2磷源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)的影響 以40 g/L葡萄糖為碳源、1.0 g/L尿素為氮源，不同磷元素濃度下的金藻生長狀況見圖7。1.0×10-4mol/L組與其他各實驗組有顯著性差異（P＜ 0.05），培養(yǎng)96 h 時，1.0×10-4mol/L組的藻細胞密度平均值達到最大，為2.13×1010mL-1，測得生物量為37.17 g/L。之后各組隨時間增加，藻細胞密度逐漸下降。

圖7 磷源濃度對球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Fig.7 Effect of phosphorus source concentration on heterotrophic culture of Isochrysis glalban

3 討論

3.1 碳源對球等鞭金藻的影響

碳源是微藻異養(yǎng)生長最關(guān)鍵的影響因素，選擇合適的碳源對微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的生物量和產(chǎn)物組成有極為關(guān)鍵的作用。不同的微藻對碳源需求不同，葡萄糖因易吸收，被普遍作為異養(yǎng)碳源。Ip Po-Fung等[11]采用混養(yǎng)培養(yǎng)方式培養(yǎng)小球藻（Chlorella zofingiensisde），當以葡萄糖作為唯一碳源，質(zhì)量濃度為30 g/L時，最適于該小球藻生長，小球藻密度達最高，可獲得高產(chǎn)量蝦青素。張帆[7]篩選2.0 g/L葡萄糖為異養(yǎng)培養(yǎng)等鞭金藻的最適碳源。

本研究中，以葡萄糖或蔗糖為唯一碳源，在一定濃度范圍內(nèi)均可促進金藻異養(yǎng)生長，這可能與避光條件下單糖和雙糖更有利于金藻的吸收利用有關(guān)。與其他微藻異養(yǎng)[7,11]相同，葡萄糖為異養(yǎng)培養(yǎng)金藻的最適碳源，當葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時，藻細胞密度最高。在實際生產(chǎn)中，可采用糖蜜產(chǎn)品作為葡萄糖的替代品，在保證培養(yǎng)過程中葡萄糖供應(yīng)的同時，還可進一步降低生產(chǎn)成本。

3.2 氮源對球等鞭金藻的影響

氮素是微藻生長必須基本元素之一，也是藻體內(nèi)合成蛋白質(zhì)、核酸及葉綠素等的主要成分。金藻對不同種類和形態(tài)氮源的吸收利用各異，并直接影響微藻的生長狀況，姜永和等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在氮源為150 mg/L硝酸鈉，自養(yǎng)培養(yǎng)至后期的等鞭金藻生物量和蛋白質(zhì)含量較高。艾江寧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當?shù)|(zhì)量濃度為1.5 g/L時，自養(yǎng)培養(yǎng)湛江等鞭金藻的總脂肪質(zhì)量分數(shù)和產(chǎn)量分別達到39.8%和0.92 g/L。本研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鈉和尿素對金藻的異養(yǎng)培養(yǎng)均有較強的促進作用，但尿素表現(xiàn)更佳，這可能是因為有機氮源比無機氮源更易被微藻吸收利用。在所研究的氮源中，尿素含氮量最高，選擇尿素作為氮源不僅成本低，且對金藻異養(yǎng)培養(yǎng)有良好的促進作用，適合在工業(yè)上作為金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的氮源。

3.3 磷源對球等鞭金藻的影響

磷是核酸和細胞膜的重要組分，在細胞的能量轉(zhuǎn)換中有重要作用。微藻異養(yǎng)以常用磷酸鹽為磷源，異養(yǎng)狀態(tài)下比自養(yǎng)狀態(tài)下利用的磷更多[14]。本研究中，三類磷酸鹽對金藻培養(yǎng)的促進作用差距不顯著，KH2PO4組的小球藻培養(yǎng)效果較其他兩類磷酸鹽略佳。這可能是因為球等鞭金藻在攝入大量鈉離子后，需通過吸收鉀離子以穩(wěn)定體內(nèi)的滲透壓。

3.4 光自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)方式的對比

異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，球等鞭金藻3011可直接利用培養(yǎng)液中的有機物，不需進行光合作用，其繁殖速度遠高于自養(yǎng)培養(yǎng)。培養(yǎng)98 h，自養(yǎng)培養(yǎng)金藻生物量為1.4×107mL-1左右[15]，而異養(yǎng)培養(yǎng)能高達2.13×1010mL-1。對于大規(guī)模生產(chǎn)，異養(yǎng)培養(yǎng)方式培養(yǎng)效率更高，培養(yǎng)時間更短。

從能源利用上來說，光自養(yǎng)需求大量高強度的光照，需足夠的場地來架設(shè)燈管，光源利用率低，CO2補加困難，所得藻細胞密度低，收獲成本高且易被其他生物污染。異養(yǎng)則需葡萄糖等有機物，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，能源利用率高，純種收獲簡單，不易出現(xiàn)污染[16]。在規(guī)?；囵B(yǎng)中，異養(yǎng)培養(yǎng)是一種新方法。

4 結(jié)論

本研究考察避光條件下不同種類及濃度的碳源、氮源對球等鞭金藻3011生長的影響，結(jié)果表明，葡萄糖、尿素、KH2PO4分別是較為適合球等鞭金藻異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源、氮源、磷源。在葡萄糖濃度40 g/L、尿素1.0g/L、KaH2PO413.6 mg/L時微藻培養(yǎng)效果最佳，細胞密度在培養(yǎng)48 h時可達109個/mL，培養(yǎng)96 h時可達到1010個/mL。相比于自養(yǎng)培養(yǎng)，異養(yǎng)狀態(tài)下微藻生長更快。