蟾蜍無(wú)痛麻醉技術(shù)在機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用探究

孫岑岑 梅汝煥 鄭 燕 方 瑜 于曉云 厲旭云 王夢(mèng)令 高鈴鈴

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江省杭州市 310058

蟾蜍的基本生命活動(dòng)和生理功能與溫血?jiǎng)游锝疲潆x體組織和器官所需的生活條件較為簡(jiǎn)單，常用于神經(jīng)生理、肌肉生理、心臟生理等實(shí)驗(yàn)[1]。在高等醫(yī)學(xué)院校實(shí)驗(yàn)教程中采用雙毀髓法處理蟾蜍，是給予實(shí)驗(yàn)蟾蜍手術(shù)疼痛處理方法的唯一動(dòng)物福利[1]；該方法在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中，由于枕骨大孔刺入位置不準(zhǔn)、插入過(guò)深過(guò)淺等原因，往往不能及時(shí)順利完成毀腦脊髓工作，給蟾蜍帶來(lái)長(zhǎng)時(shí)間的巨大痛苦，抑或操作不當(dāng)，發(fā)生蟾汁噴射到操作者眼睛等安全事件。其實(shí)，兩棲類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的毀腦脊髓法，在國(guó)外普遍已被麻醉劑法取代，不少學(xué)者呼吁放棄使用毀腦脊髓法、淋巴囊注射法或冷凍法用于兩棲動(dòng)物的制動(dòng)處理，以最大限度減輕對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害[2-3]。然而，由于毀腦脊髓法對(duì)心臟和神經(jīng)—腓腸肌損傷最小，且尚未找到合適的替代方法(對(duì)心臟和腓腸肌標(biāo)本無(wú)影響，且最大限度地降低對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損傷)，雙毀髓法仍是國(guó)內(nèi)尤其是教學(xué)實(shí)驗(yàn)中最普遍使用的方法。亦有研究報(bào)道可用淋巴囊注射烏拉坦麻醉法替代毀腦脊髓法用于蟾蜍心臟實(shí)驗(yàn)[4]，但淋巴囊注射對(duì)于實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求更高，不易掌握，不適合在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用。因此，為了更加科學(xué)、合理、人道地使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探索新的蟾蜍制動(dòng)方法以取代教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的毀腦脊髓法具有重要意義。

蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌興奮與收縮實(shí)驗(yàn)和離體心臟實(shí)驗(yàn)是最為常見(jiàn)和經(jīng)典的生理教學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于學(xué)生深入認(rèn)識(shí)和理解神經(jīng)肌肉興奮收縮和心肌收縮調(diào)控的基本生理學(xué)知識(shí)具有重要意義[1]。為此，本研究選擇上述兩個(gè)蟾蜍實(shí)驗(yàn)作為研究背景，選用多種麻醉劑處理蟾蜍，檢測(cè)各麻醉劑對(duì)蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌和心肌的影響，以篩選最佳替代毀腦脊髓的方法，從而最大限度減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物機(jī)體的損傷，減輕動(dòng)物遭受的痛苦和應(yīng)激反應(yīng)，并獲得客觀、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康中華蟾蜍指名亞種(Bufo gargarizans gargarizans Cantor，Zhoushan Toad)，雌雄不均，由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有的操作均符合動(dòng)物福利的要求。(2)實(shí)驗(yàn)試劑：異丙酚，分析純，購(gòu)于力邦制藥，批號(hào)H20010368；戊巴比妥鈉，分析純，購(gòu)于sigma，貨號(hào) P3761；氨基甲酸乙酯，分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)3019228；MS-222，分析純，購(gòu)于Adamas，貨號(hào)88345。(3)實(shí)驗(yàn)儀器：張力換能器(成都儀器廠)，RM6240BD型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理：將蟾蜍[中華蟾蜍指名亞種，(120±15)g]按體重和性別平均分到五組，分別為毀腦脊髓組(采用傳統(tǒng)的毀腦脊髓的方法處理蟾蜍)；異丙酚組(濃度10g/L, 1ml/100g進(jìn)行腹腔麻醉)；戊巴比妥鈉組(濃度2%，0.4ml/100g進(jìn)行腹腔麻醉)；氨基甲酸乙酯組(濃度10%，2ml/100g進(jìn)行腹腔麻醉)；MS-222組[1g/L MS-222溶液(NaHCO3調(diào)至pH 7.2～7.4)中浸泡10～15min即可麻醉][2,5]。(2)在體蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌興奮收縮實(shí)驗(yàn)：采用不同方法制動(dòng)處理的蟾蜍，分離坐骨神經(jīng)和腓腸肌，利用RM6240對(duì)腓腸肌收縮的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。①閾強(qiáng)度：前負(fù)荷2.5g，波寬0.1ms，波間隔1 000ms,測(cè)定不同刺激強(qiáng)度下的收縮張力；②最適前負(fù)荷：最大刺激強(qiáng)度為本次實(shí)驗(yàn)的刺激強(qiáng)度，波寬0.1ms，波間隔1 000ms，測(cè)定不同前負(fù)荷下的收縮張力；③最適波間隔的測(cè)定:最大刺激強(qiáng)度和最適前負(fù)荷作為本次實(shí)驗(yàn)的刺激強(qiáng)度和前負(fù)荷，波寬0.1ms，脈沖數(shù)2個(gè)，測(cè)定不同波間隔下的收縮張力；④最適肌肉持續(xù)興奮時(shí)間：最大刺激強(qiáng)度、最適前負(fù)荷和最適波間隔作為實(shí)驗(yàn)刺激參數(shù)，波寬0.1ms，測(cè)定不同脈沖數(shù)時(shí)的收縮張力。(3)蟾蜍離體心臟實(shí)驗(yàn)：采用不同方法制動(dòng)處理的蟾蜍，分離制備蛙心標(biāo)本并進(jìn)行蛙心插管，與張力換能器連接。①不同麻醉劑對(duì)蛙心搏動(dòng)的影響：向插管中加入1ml任氏液，心搏曲線穩(wěn)定后記錄正常的心搏曲線45s，并測(cè)定蛙心最大收縮壓(EST)、最大舒張壓(EDT)、心率(HR)。②不同藥物對(duì)蛙心搏動(dòng)的影響：向灌流液(1ml)中加入不同藥物(0.5% CaCl2溶液25μl、1.5% KCl溶液20μl、6×10-6mol/L乙酰膽堿15μl、腎上腺素溶液10μl), 心搏曲線穩(wěn)定后記錄45s數(shù)據(jù)。每次實(shí)驗(yàn)后均用任氏液反復(fù)沖洗以去除藥物殘留。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 骨骼肌收縮張力的大小與前負(fù)荷、刺激強(qiáng)度、刺激時(shí)間、刺激頻率等有關(guān)，刺激參數(shù)不同，骨骼肌的收縮張力也不同。故分別選擇閾刺激強(qiáng)度，最大刺激強(qiáng)度、最適前負(fù)荷、最適波間隔、最適興奮持續(xù)時(shí)間及其相應(yīng)的收縮力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)坐骨神經(jīng)—腓腸肌的興奮收縮性能進(jìn)行多方面的評(píng)估。心臟的興奮收縮性能可通過(guò)最大收縮壓(EST)、最大舒張壓(EDT)、心率(HR)進(jìn)行評(píng)價(jià)，細(xì)胞外液的鈉、鉀及鈣等離子對(duì)心肌細(xì)胞的自律性、興奮性、傳導(dǎo)性和收縮性產(chǎn)生影響。故選擇EST、EDT和HR作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)不同麻醉制動(dòng)處理的離體心臟及其藥物處理前后的興奮收縮性能進(jìn)行測(cè)定，比較并評(píng)價(jià)不同麻醉劑對(duì)心臟的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異通過(guò)two-tailed Student’st-test進(jìn)行分析計(jì)算。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同麻醉劑對(duì)腓腸肌收縮張力的影響 分別用戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯、異丙酚和MS-222對(duì)蟾蜍進(jìn)行麻醉處理，毀腦脊髓組作為對(duì)照，檢測(cè)不同麻醉劑對(duì)坐骨神經(jīng)—腓腸肌興奮與收縮的影響。結(jié)果顯示，在2.5g前負(fù)荷、0.1ms波寬單刺激條件下，各麻醉組樣本的最大刺激強(qiáng)度均與毀腦脊髓組無(wú)明顯區(qū)別，但MS-222、戊巴比妥鈉組腓腸肌閾刺激強(qiáng)度顯著高于毀腦脊髓組，而最大收縮張力明顯低于毀腦脊髓組；氨基甲酸乙酯組腓腸肌的閾強(qiáng)度與毀腦脊髓組比無(wú)顯著性差異，但最大收縮張力明顯低于毀腦脊髓組；而異丙酚組腓腸肌的各項(xiàng)指標(biāo)(閾強(qiáng)度、最大刺激強(qiáng)度及收縮張力)均與毀腦脊髓組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1、圖1A～B。故選擇異丙酚麻醉組進(jìn)行后續(xù)的神經(jīng)—腓腸肌研究。見(jiàn)圖1。

表1 不同麻醉劑制動(dòng)處理的坐骨神經(jīng)—腓腸肌的閾刺激和最大刺激強(qiáng)度及相應(yīng)的收縮張力

2.2 異丙酚對(duì)腓腸肌收縮的影響 用異丙酚對(duì)蟾蜍進(jìn)行麻醉處理，對(duì)不同刺激條件下的腓腸肌收縮張力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，異丙酚麻醉組和毀腦脊髓對(duì)照組的腓腸肌收縮變化趨勢(shì)均一致，無(wú)明顯差異(P>0.05)。二者的最適前負(fù)荷、最適波間隔及最適興奮持續(xù)時(shí)間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1C～E。同時(shí)，在最適前負(fù)荷、最適波間隔、最適肌肉持續(xù)興奮時(shí)間、最大刺激強(qiáng)度的電刺激作用下，異丙酚組的腓腸肌達(dá)到最大收縮張力為(335.99±40.52)g，與對(duì)照組的(348.11±36.17)g比較無(wú)顯著性差異，(P>0.05)。見(jiàn)圖1E。

圖1 不同麻醉劑對(duì)蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌的影響

2.3 麻醉劑對(duì)蟾蜍離體心臟搏動(dòng)的影響 分別用戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯、異丙酚和MS-222對(duì)蟾蜍進(jìn)行麻醉處理，毀腦脊髓組作為對(duì)照，檢測(cè)不同麻醉劑對(duì)蟾蜍離體心臟搏動(dòng)的影響。

與毀腦脊髓組相比，戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯麻醉處理的蟾蜍，其心臟的EST、EDT和 HR均有顯著性降低，且氨基甲酸乙酯處理的蟾蜍其心臟搏動(dòng)曲線出現(xiàn)明顯波動(dòng)異常，而異丙酚麻醉的蟾蜍其離體心臟的EST和EDT與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，但HR明顯降低，說(shuō)明上述三種麻醉劑對(duì)蛙心搏動(dòng)均有不同程度的影響(圖2、圖3A～C)。而MS-222浸泡法處理的蟾蜍，其離體心臟的EST、EDT和HR與對(duì)照組均無(wú)明顯差異(P>0.05)。說(shuō)明MS-222對(duì)蛙心的搏動(dòng)無(wú)明顯影響，故選擇MS-222浸泡麻醉組進(jìn)行后續(xù)研究(圖2、圖3A～C)。

圖2 不同麻醉劑處理的蟾蜍離體心臟的心搏曲線

2.4 MS-222對(duì)藥物處理的蛙心搏動(dòng)的影響 選擇MS-222浸泡處理的蟾蜍作為實(shí)驗(yàn)組，毀腦脊髓處理的蟾蜍作為對(duì)照組，分離蛙心，分別記錄CaCl2、KCl、乙酰膽堿和腎上腺素處理前后蛙心的EST、EDT和HR的變化情況。結(jié)果如圖3所示，MS-222實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛙心的EST、EDT和HR變化趨勢(shì)均完全一致，無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3D～F。

圖3 不同麻醉劑對(duì)蟾蜍離體心臟的影響

3 討論

不同麻醉劑對(duì)不同的組織、系統(tǒng)等影響不同[6-12]，且麻醉劑腹腔麻醉后對(duì)蟾蜍坐骨神經(jīng)—骨骼肌和離體心臟是否受到影響或影響程度大小尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，戊巴比妥鈉和氨基甲酸乙酯麻醉處理的蟾蜍，其腓腸肌和心臟收縮均受到明顯抑制，說(shuō)明兩種麻醉劑均不適合作為神經(jīng)—腓腸肌和蛙心實(shí)驗(yàn)的制動(dòng)方法。

異丙酚是目前最新的靜脈麻醉藥，已被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉和ICU鎮(zhèn)靜。已有文獻(xiàn)報(bào)道異丙酚可顯著抑制大鼠心肌收縮[13]，但其對(duì)蟾蜍骨骼肌和心臟的影響尚無(wú)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚麻醉法對(duì)蟾蜍心臟搏動(dòng)有影響，但用異丙酚麻醉的蟾蜍其腓腸肌收縮的各項(xiàng)指標(biāo)及變化趨勢(shì)均與毀腦脊髓組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明異丙酚對(duì)坐骨神經(jīng)—腓腸肌的興奮與收縮無(wú)影響或影響不明顯。故異丙酚可作為替代法用于神經(jīng)—腓腸肌實(shí)驗(yàn)中的蟾蜍制動(dòng)處理。

MS-222，(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate)，俗稱魚安定等，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的唯一活魚運(yùn)輸麻醉劑[14]。MS-222還用于各種水產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)室研究領(lǐng)域，已被用于多種實(shí)驗(yàn)用魚或兩棲動(dòng)物的麻醉[2,5,15-16]。但該麻醉劑用于中華蟾蜍的研究鮮有報(bào)道，同時(shí)MS-222對(duì)神經(jīng)—腓腸肌和離體心臟的影響更無(wú)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，1% 的MS-222浸泡處理的蟾蜍，其腓腸肌收縮力明顯減弱，但心臟搏動(dòng)(EST、EDT、HR)與毀腦脊髓處理組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明MS-222對(duì)心臟沒(méi)有影響或影響極小，故MS-222可作為蟾蜍心臟實(shí)驗(yàn)的麻醉劑。

用MS-222浸泡法和異丙酚腹腔注射法處理蟾蜍，有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：(1)人道主義，善待動(dòng)物，該方法可最大限度地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物——蟾蜍的痛苦，異丙酚麻醉后的蟾蜍5min之內(nèi)即可進(jìn)入麻醉狀態(tài)，用1% MS-222浸泡處理的蟾蜍10～15min即可麻醉；(2)操作簡(jiǎn)單，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生更易掌握，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行；(3)安全角度，該方法可最大限度地避免和減少由于操作不當(dāng)而造成的意外，保證學(xué)生的人身安全；(4)增強(qiáng)學(xué)生動(dòng)物福利方面的意識(shí)，加強(qiáng)動(dòng)物倫理方面的教育，有助于學(xué)生醫(yī)德的培養(yǎng)。

總之，本研究以醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蟾蜍為研究對(duì)象，首次就多種麻醉劑在經(jīng)典生理實(shí)驗(yàn)——神經(jīng)—腓腸肌興奮收縮實(shí)驗(yàn)和離體蛙心實(shí)驗(yàn)中的影響進(jìn)行充分探討，首次確定了異丙酚腹腔麻醉和MS-222浸泡麻醉法分別對(duì)神經(jīng)—腓腸肌和心臟不產(chǎn)生明顯影響，并首次確定了二者可作為神經(jīng)—腓腸肌實(shí)驗(yàn)和心臟實(shí)驗(yàn)的毀腦脊髓固定法的替代方法，該方法簡(jiǎn)單易行，對(duì)操作技術(shù)要求低，同時(shí)避免對(duì)蟾蜍的過(guò)度傷害，可廣泛用于今后的教學(xué)和科研實(shí)驗(yàn)。