海南桑樹栽培品種桑葉中1-脫氧野尻含量的測定

何際嬋 董志超

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南海口 571737)

桑葉為?？疲∕oraceae）植物桑（Morus alba L.）的葉，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目的功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑葉中含有多種羥基生物堿，其中以1-脫氧野尻霉素（DNJ）為代表的多羥基生物堿是桑葉中重要的降血糖成分［2-3］。DNJ 是從桑樹中發(fā)現(xiàn)的一種天然哌啶生物堿，它可競爭性地抑制小腸粘膜上的ɑ-糖苷酶的活性，減緩葡萄糖的吸收速率，降低餐后血糖濃度，從而發(fā)揮治療糖尿病的作用［4-5］。但桑葉的DNJ 含量受桑樹品種、生長環(huán)境、桑葉部位等影響較大［6］。任立松等［7］為探明東北地區(qū)不同桑樹品種間1-脫氧野尻霉素含量的差異，對10 個現(xiàn)行品種葉片中的DNJ含量進行了測定，結(jié)果表明不同品種間DNJ 含量存在一定的差異。禚蘇等［8］安康地區(qū)具有代表性的24 個桑樹栽培品種桑葉為原材料，運用反相高效液相色潽法測定各品種春季桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量，結(jié)果表明，安康地區(qū)桑樹品種中桑葉DNJ 含量具有顯著差異。

近幾年，在“東桑西移”“北桑南移”的結(jié)構(gòu)性區(qū)域調(diào)整下，海南的蠶桑產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展［9］，并建立了桑樹種質(zhì)資源圃。

但目前尚未見有關(guān)海南種植桑葉品種DNJ含量測定的報道。DNJ 因其結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)色團，所以很難采用HPLC 法直接測定。目前，桑葉中DNJ 的檢測多采用HPLC-ELSD法［10］、HPLC-FLU法［11］、HPLCMS法［12］和柱前衍生化HPLC-UV法［13］等。本研究運用柱前衍生化HPLC-UV 法對海南省目前種植的31個桑樹品種桑葉進行DNJ含量測定，為桑葉在海南的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

供試材料為海南創(chuàng)科農(nóng)旅集團桑樹種質(zhì)資源圃中栽植的海南省主要桑種品種，包括粵桑11號、黑珍珠、日本甜桑、胖果桑、強桑2號、大十、紅果2 號、紅果5 號、抗青283、桂桑優(yōu)62、桂桑6號、農(nóng)桑14號、新西蘭垂桑、新西蘭九曲龍桑等，共31 個品種。于2020 年6 月，取桑枝頂自下7、8 片葉，于50℃烘干至恒重，將以上樣品粉碎后過60目篩，備用。

1.1.2 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（G1329A 自動控溫進樣器，G1311A 四元泵，G1316A 柱溫箱；美國安捷倫公司）；電子天平（BSA224S—CW；賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ－700DA 型；江蘇昆山）；高速冷凍離心機（Thermo Fisfer）；GZX－9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.1.3 試劑

1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，10027491），美國麥克林公司；9-氯甲酸芴甲酯（FMOC-CL，純度＞98%，C10074878），美國麥克林公司；乙腈（色譜純，178508），德國默克公司；氯化鉀、硼酸、氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；水為雙重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

參考鄭曉靜等［14］的方法，并略有改動。色譜柱：Waters C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1% 醋酸（35∶65，V/V）；流速：1.00 mL/min；柱溫： 30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

1.2.2 對照品與供試品溶液的制備

精密稱取DNJ 對照品10 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，搖勻，得1.0 mg/mL對照品溶液，置冰箱備用。

精密稱取供試桑葉粉0.5 g 于15 mL 離心管中，加入6 mL 50%乙醇水溶液，超聲提取30 min（溫度50℃，功率200 W）；以5 000 r/min 離心30 min，收集上清液，重復(fù)提取3次，合并3次提取液。

1.2.3 DNJ的衍生化

桑葉供試品溶液及DNJ對照品溶液的衍生化反應(yīng)參照文獻［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，依照上述色譜條件測定。以峰面積作為縱坐標(biāo)，以濃度作為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，回歸方程為：y=47 820.489x+247.586 82 （r=0.994 9，n=5）。結(jié)果表明，DNJ 在0.308～12.622 μg 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。HPLC圖譜見圖1。

2.2 精密度試驗

精密吸取同一份供試液，連續(xù)進樣5次，每次進樣10 μL，計算峰面積得RSD=1.08%。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取同一份桑葉的供試品溶液，分別在第1、3、5、8、10、12 h 進樣，每次進樣10 μL，按上述色譜條件測定，測定峰面積，計算得RSD=0.89%（n=6），結(jié)果顯示，該溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性實驗

依照供試品溶液制備方法平行制備5 份強桑2號桑葉供試品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積，計算得RSD=1.45%（n=5），結(jié)果顯示，該方法具有較好的重現(xiàn)性。

圖1 1-脫氧野尻霉素對照品（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖

2.5 加樣回收率實驗

稱取6份已知含量的強桑2號粉末各0.1 g，分別加入DNJ 對照品溶液，按“1.2.2”方法制備溶液，再按上述色譜條件測定含量，計算回收率。結(jié)果得平均回收率為99.5%，RSD=1.90%（n=6），表明本測試方法符合加樣回收率的要求，結(jié)果見表1。

表1 DNJ的加樣回收率

2.6 方法檢測限及定量限的確定

方法檢測限、定量限是通過所測得色譜峰的信噪比（S/N）來確定。S/N=3 對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為該方法的檢測限；S/N=10對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為該方法的定量限。通過柱前衍生化HPLC-UV法測定不斷稀釋的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到該方法的檢測限和定量限分別為0.23、0.65 μg/mL。

2.7 樣品測定

按“1.2.2”方法制備3 份樣品，再分別進行樣品測定，結(jié)果見表2。海南栽培的31個桑樹品種中，有3 個桑樹品種的DNJ 含量在3.00 mg/g 以上，即強桑2 號、大十、大白珍珠；其中DNJ 含量最高的是強桑2 號，為3.68 mg/g，其次為大十、大白珍珠，分別為3.23、3.15 mg/g；有7 個桑樹品種的DNJ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在2.00～3.00 mg/g：抗青283、桂桑優(yōu)62、日本甜桑、胖果桑、強桑3 號、油桑和陜860；有19個桑樹品種的DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在1.00～2.00 mg/g。而黑珍珠桑、桂芒桑、紅果5 號等桑葉品種DNJ含量較低，分別為0.62、0.88、0.96 mg/g。

3 討論

結(jié)果表明，不同品種DNJ 含量的變化較大，DNJ 含量3.68～0.62 mg/g，其中強桑2 號中DNJ 含量最高，為3.68 mg/g；黑珍珠桑DNJ 含量最低（0.62 mg/g）；強桑2號中DNJ含量是黑珍珠桑的5.93倍。說明不同桑樹品種產(chǎn)生的DNJ 有差異，為選育高DNJ 含量的桑樹品種奠定基礎(chǔ)。強桑2 號不但DNJ 含量最高，且葉片肥大，可以作為DNJ類的藥食產(chǎn)品開發(fā)原材料。

鄭曉靜等［14］用RP-HPLC 方法對桑葉中的DNJ 含量進行了測定，該方法最大的特點是沒有加入甘氨酸和0.1%的醋酸終止DNJ 的衍生化反應(yīng)。從本實驗借鑒該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及回收率的測定結(jié)果來看，只要在12 h 內(nèi)完成檢測，即表明該方法穩(wěn)定可靠且更簡便。

表2 不同品種桑葉中DNJ的含量

本實驗考查了酸水、去離子水、稀醇3種溶劑對DNJ 提取率的影響，結(jié)果表明稀醇提取的DNJ 含量最高，最終選擇稀醇作為提取溶劑。

有文獻報道稱，DNJ 的日服用有效劑量至少為6 mg，才能起到預(yù)防或治療糖尿病的目的，而桑葉中DNJ 的含量偏低，如何有效提高桑葉中DNJ 的含量將是未來一段時間內(nèi)桑葉研究的方向之一。