斑蘭葉不同愈傷組織芽分化與抗氧化酶類關(guān)系

吉訓(xùn)志 秦曉威 楊藝秋 胡麗松 范睿 郝朝運(yùn)

(1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所 海南萬寧 571533;2 農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬寧 571533;3 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬寧 571533;4 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院 云南普洱 665000)

斑蘭葉（Pandanus amaryllifolius Roxb.），又稱香露兜、班蘭葉、斑斕葉，屬露兜科草本植物，是露兜科中唯一葉片具有芳香氣味的品種［1-2］。斑蘭葉擁有直立的地上莖，長(zhǎng)而明亮的綠色劍形葉，發(fā)達(dá)的氣生根，并且這種植物是不育的，幾乎不開花，通過主莖上的芽進(jìn)行繁育［3-4］。由于其葉片具有米香味，在東南亞及印度地區(qū)常被用于添加到蛋糕、飲品及菜肴中，以此提升食品風(fēng)味［5］。斑蘭葉葉片除了烹飪價(jià)值外，它還因其治療特性，在民間醫(yī)學(xué)中廣為人知，鮮葉片的水提物有降火功效，對(duì)治療內(nèi)熱、感冒、咳嗽和麻疹非常有效［6］。因此，斑蘭葉在脫貧攻堅(jiān)與間作增效方面的作用日益突出。近年來，除了對(duì)斑蘭葉葉片的香氣成分進(jìn)行分析研究［7］，也有對(duì)其進(jìn)行離體再生方面的研究。

斑蘭葉花果未見，因此主要是以2年生以上老莖的側(cè)芽進(jìn)行分株繁育，通過愈傷組織誘導(dǎo)及叢生芽再生，能夠極大地發(fā)揮其分化再生能力，無需擁有2年生的老莖，愈傷組織就能分化出大量叢生芽，以進(jìn)行斑蘭葉種苗的高通量繁育，此方法受外界環(huán)境影響較小，分化芽的生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)一致，是基因工程育種的理想材料［8-9］。國(guó)內(nèi)外也有學(xué)者對(duì)斑蘭葉的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究。王景飛等［10］利用香露兜地上莖，誘導(dǎo)叢生芽分化，生根成完整植株，并確定了最佳誘導(dǎo)條件，不過該文主要研究不同激素對(duì)芽的誘導(dǎo)與增殖影響，并未涉及愈傷組織誘導(dǎo)與斑蘭葉組培再生的整個(gè)過程。Wakte 等［8］研究了斑蘭葉從愈傷組織開始的分化再生過程，不過對(duì)于外植體材料的選擇，沒有明確的說明。而Gangopadhyay 等［9］也對(duì)斑蘭葉的組培再生進(jìn)行了探索，并通過以老莖上的側(cè)芽為外植體獲得了成功，不過該文主要是研究組培苗提高了2AP 香氣成分，對(duì)于組培過程只是粗略提及。另外，斑蘭葉處具有類似米香的特征香氣外，還具有很強(qiáng)的抗氧化性而被關(guān)注［11-12］。不過斑蘭葉抗氧化特性的研究主要針對(duì)于斑蘭葉葉片，尚未見有關(guān)于斑蘭葉愈傷組織及叢生芽的抗氧化特性研究報(bào)道。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，探討斑蘭葉愈傷組織抗氧化酶與芽分化之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步完善建立斑蘭葉的組織培養(yǎng)技術(shù)，為提高斑蘭葉愈傷組織的芽分化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來自于海南省萬寧市興隆熱帶植物園（18°15′，10°13′）的斑蘭葉地，以上莖、嫩葉及老莖上的側(cè)芽作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體材料培養(yǎng)

將長(zhǎng)勢(shì)健康的斑蘭葉根蘗苗上的外植體放置在恒溫箱（25±2℃）中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)40 d后觀察試驗(yàn)材料的生長(zhǎng)情況并進(jìn)行取樣。

1.2.2 外植體滅菌

選擇無病害的健康植株，清水洗凈后，將地上莖切成0.5 cm 的小段，健康的葉片切成0.5 cm2的面積大小，從3 年生的斑蘭葉老莖上截取0.5～0.8 cm 的側(cè)芽。將上述3 種外植體材料，用洗滌劑浸泡0.5 h 后，流水沖洗干凈，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)中，用75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌3 次，再用0.1%升汞滅菌10 min，無菌水洗滌4～5 次，瀝干水分后，接種到MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d 左右統(tǒng)計(jì)外植體材料的污染率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

將上述無污染的地上莖、嫩葉及側(cè)芽3種外植體接種到培養(yǎng)基1 和2（具體配方詳見表1）兩種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，40 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.4 愈傷組織增殖及叢生芽誘導(dǎo)方法

將誘導(dǎo)得到的斑蘭葉愈傷組織接種到培養(yǎng)基3、4、5（具體配方詳見表1）上進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，30 d后觀察叢生芽分化情況。

表1 本試驗(yàn)用培養(yǎng)基

1.2.5 抗氧化酶類活性測(cè)定

挑取斑蘭葉不同類型愈傷組織0.1 g，先將愈傷組織放在立體顯微鏡（STEMI 2000-C）上進(jìn)行拍照記錄，后裝入2 mL離心管中加入1 mL酶活提取液與2 顆直徑為0.3 cm 左右的小鋼珠在高通量組織研磨機(jī)（TissueLyserⅡ，28 Hz，2 min）中進(jìn)行粉碎后，8 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，利用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的CAT、POD 與SOD試劑盒在雙光束紫外可見分光光度計(jì)（UV2310Ⅱ）上對(duì)斑蘭葉不同類型愈傷組織酶活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果用WPS office 2016 與IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行處理，分析數(shù)據(jù)并生成圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑蘭葉的愈傷誘導(dǎo)及叢生芽再生

在對(duì)斑蘭葉3種類型外植體材料進(jìn)行滅菌的過程中發(fā)現(xiàn)，地上莖、嫩葉與側(cè)芽在經(jīng)消毒滅菌后沒有呈現(xiàn)出褐化現(xiàn)象。不過在接種7 d 后，嫩葉四周開始有雜菌滋生，且污染率達(dá)92%左右；地上莖的污染發(fā)生在接種10 d 左右，內(nèi)生菌叢地上莖接觸培養(yǎng)基的部分開始延綿開來，污染率在30%左右；側(cè)芽的污染情況也與地上莖相似，有時(shí)會(huì)整株覆蓋霉菌，其污染率在28%左右；由此可見，斑蘭葉內(nèi)生菌較多，滅菌較為困難，需要進(jìn)一步改進(jìn)滅菌方法。

如表2 所示，在對(duì)斑蘭葉3 種類型外植體材料誘導(dǎo)愈傷組織過程中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)30 d 左右，3 種外植體材料中只有側(cè)芽在光培養(yǎng)14 d 時(shí)，在含TDZ與6-BA激素的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基2）上側(cè)芽基部開始膨大，繼續(xù)培養(yǎng)，基部顏色由綠轉(zhuǎn)白，在培養(yǎng)30 d左右，基部開始長(zhǎng)出黃綠色的愈傷組織（圖1-a），誘導(dǎo)率達(dá)79%左右，而在含2，4-D 和6-BA 的培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基1）愈傷組織誘導(dǎo)率為13%；嫩葉與地上莖無論是光培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)都沒有萌動(dòng)的跡象。

將斑蘭葉愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加NAA與6-BA 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d 的過程中，基部愈傷組織不斷增大，逐漸形成黃綠色，堆積成團(tuán)與質(zhì)地硬的大塊愈傷組織塊（圖1-b），隨后黃綠色愈傷組織部分開始變褐，不過愈傷組織塊仍質(zhì)地硬（圖1-c）。將其轉(zhuǎn)接到添加KT 與6-BA 的培養(yǎng)基或只含KT 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d 左右，含KT 與6-BA的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基4）中愈傷組織的黃綠色部分開始分化出叢生芽（圖1-d），叢生芽分化率都在90%左右（表2）；而只含KT 的培養(yǎng)基上，愈傷組織黃綠部分逐漸變白，褐化部分顏色變深成褐白色愈傷組織（圖1-e），再繼續(xù)培養(yǎng)25 d 左右，部分叢生芽會(huì)進(jìn)一步伸長(zhǎng)變粗，最終生成類似老莖上的側(cè)芽結(jié)構(gòu)。而褐白色愈傷組織則進(jìn)一步變褐，變成黑褐色愈傷組織（圖1-f），失去分化的能力。另外少數(shù)的黃綠色愈傷組織團(tuán)會(huì)分化出粗壯的根系，進(jìn)而影響叢生芽的分化與自身的增殖。5 種愈傷組織的分化關(guān)系為，側(cè)芽基部愈傷組織（圖1-a）先增殖分化為黃綠色愈傷組織（圖1-b），在添加KT 與6-BA 的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)為黃褐色愈傷組織（圖1-c），最終由黃褐色愈傷組織（圖1-c）分化出芽，為芽分化愈傷組織（圖1-d）；另一方面，在只含KT 的培養(yǎng)基上，黃綠色愈傷組織（圖1-b）培養(yǎng)成褐白色愈傷組織（圖1-e），繼續(xù)培養(yǎng)為黑褐色愈傷組織（圖1-f），無芽分化。

表2 不同培養(yǎng)方法愈傷組織誘導(dǎo)率、叢生芽誘導(dǎo)率對(duì)比

2.2 斑蘭葉不同類型愈傷的抗氧化酶類比較分析

如圖2所示，在對(duì)斑蘭葉不同類型愈傷組織的過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定中，不同類型愈傷組織的CAT活性相差不大，其中褐白色愈傷組織的CAT 活性顯著低于其他，為91.43 U/g。黃綠色愈傷組織是斑蘭葉開始芽分化時(shí)的狀態(tài)，隨后稍微變褐后再分化出叢生芽，這個(gè)過程中CAT活性呈先升后降的趨勢(shì)，但黃綠色愈傷組織在轉(zhuǎn)變成黃褐色愈傷組織再分化出的芽分化愈傷組織的CAT活性變化不大。另外從黃綠色愈傷組織生長(zhǎng)成褐白色愈傷組織時(shí)，CAT 活性降低至接近于零，而后到黑褐色愈傷組織時(shí)的CAT 活性回升，但這2 種愈傷組織CAT活性都低于黃綠色愈傷組織。

在對(duì)斑蘭葉不同類型愈傷組織的過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定中，以黃綠色愈傷組織的POD活性最高，為6 237.17 U/g，黃褐色愈傷組織POD 活性最低，為2 144.94 U/g，其余的POD 活性相似。根據(jù)上述的斑蘭葉愈傷組織芽分化過程，POD 活性呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，其中黃褐色愈傷組織POD活性在顯著下降后回升，使其轉(zhuǎn)變成芽分化愈傷組織。而黃綠色愈傷組織的無分化途徑中，POD 活性有所下降后就無變化，這使得褐白愈傷組織沒有進(jìn)行分化，進(jìn)而變成黑褐色愈傷組織。

在對(duì)斑蘭葉不同類型愈傷組織的超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定中，不同類型愈傷組織的SOD 活性普遍較低，其中褐白色愈傷組織的SOD 活性最高，為513.05 U/g。斑蘭葉愈傷組織芽分化過程中，SOD 活性呈先升后降的趨勢(shì)，其中黃褐色愈傷組織的SOD活性要高于黃綠色愈傷組織與芽分化愈傷組織的SOD活性，其中黃綠色愈傷組織比芽分化愈傷組織SOD活性還低。而黃綠色愈傷組織的無分化途徑中，也呈先升后降的趨勢(shì)，褐白色愈傷組織SOD活性顯著高于黃綠色愈傷組織與黑褐色愈傷組織SOD活性，而黃綠色愈傷組織與黑褐色愈傷組織SOD活性都較低。

圖1 斑蘭葉不同類型愈傷組織及誘導(dǎo)叢生芽

圖2 斑蘭葉不同愈傷組織類型的抗氧化酶活性比較分析

3 討論

3.1 斑蘭葉的愈傷誘導(dǎo)及叢生芽再生

組培快繁是基于細(xì)胞全能性的理論，首先通過以母本組織為外植體，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下誘導(dǎo)出愈傷組織，并通過大量增殖愈傷組織來替代直接截取母體組織，再將愈傷組織分化出叢生芽，將叢生芽分成多條芽段，最終生根成完整植株。本文在前人對(duì)于斑蘭葉組培再生方面的研究基礎(chǔ)上，明確了只有老莖上0.3 cm 左右的側(cè)芽才具有再生分化能力。并且在叢生芽的誘導(dǎo)過程中，6-BA 與NAA 起到關(guān)鍵作用，而且愈傷組織在誘導(dǎo)叢生芽時(shí)，發(fā)現(xiàn)只含KT的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)叢生芽，而擁有6-BA激素的培養(yǎng)基才能誘導(dǎo)出叢生芽。這與前人的6-BA 在誘導(dǎo)叢生芽中起著關(guān)鍵作用的研究結(jié)果一致［13-14］。另外TDZ與6-BA才能激發(fā)側(cè)芽基部分化出愈傷組織，24-D 主要用于愈傷組織的增殖，對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)沒有效果，這與前人研究成果不一致，也是對(duì)斑蘭葉組培技術(shù)的新發(fā)現(xiàn)。斑蘭葉愈傷組織誘導(dǎo)出來后，不能馬上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，要先進(jìn)行愈傷組織約30 d 的繼代增殖過程，一般需斑蘭葉愈傷組織團(tuán)增大至直徑1.5 cm左右，再運(yùn)用含6-BA激素的培養(yǎng)基，才能使愈傷組織大量分化出叢生芽，而這可能與其需要為再分化積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，這是對(duì)斑蘭葉組培技術(shù)的補(bǔ)充。因此，本研究的成果是對(duì)斑蘭葉組培再生技術(shù)的重要補(bǔ)充，為穩(wěn)定建立斑蘭葉組培技術(shù)體系提供技術(shù)支撐。

3.2 斑蘭葉不同類型愈傷的抗氧化酶類比較分析

植物細(xì)胞的脫分化與再分化過程，不僅使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生重大變化，還涉及一系列的生理生化特性的變化［15-16］。本文對(duì)不同類型愈傷組織的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）與超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶類進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)斑蘭葉愈傷組織分化過程中的CAT 與SOD 活性的變化相似，都是先升后降，而POD 活性變化則相反。同時(shí)POD 活性在愈傷組織芽分化與無分化中都遠(yuǎn)高于CAT 與SOD 活性。另一方面在能分化出芽的黃褐色愈傷組織與不能分化出芽的褐白色愈傷組織中，前者的POD 活性顯著低于后者的POD 活性，前者的CAT 活性高于后者的CAT 活性，而后者的SOD活性高于前者的SOD 活性。前人在對(duì)尾葉桉［17］與尾巨桉［18］的不同愈傷組織芽分化的抗氧化酶類活性關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)尾葉桉能夠芽分化的淺綠色愈傷組織POD、CAT 與SOD 活性最高，同樣在尾巨桉中POD 與SOD 活性高的愈傷組織芽分化的誘導(dǎo)率高。在對(duì)新疆雪蓮［19］芽分化的抗氧化酶體系活性變化的研究中，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的SOD活性在分化中都逐漸增大，而胚性愈傷組織的POD 活性要高于非胚性愈傷組織，CAT 也在芽分化時(shí)活性增大。上述的研究結(jié)果表明，抗氧化酶類對(duì)愈傷組織的芽分化起著重要作用，這與本文能夠分化叢生芽的黃褐色愈傷組織POD活性高的研究結(jié)果一致，不過本文中不同類型愈傷組織的POD 活性都要高于CAT 與SOD。斑蘭葉本身就具有較高的抗氧化活性［20］，因此一些愈傷組織就算不具備芽分化能力也具有較高的抗氧化酶活性，本研究結(jié)果顯示POD可能在斑蘭葉愈傷組織的抗氧化酶類中占據(jù)主要地位。另外，從不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽的情況上看，只含KT 的培養(yǎng)基上，斑蘭葉愈傷組織不能誘導(dǎo)出叢生芽，最終生長(zhǎng)成黑褐色愈傷組織。不過黑褐色愈傷組織的CAT、POD與SOD 等酶活性與芽分化愈傷組織的酶活性相似，可能黑褐色愈傷組織仍具有芽分化的能力，可能缺乏6-BA 激素來促使叢生芽的分化，而這潛在的生理生化機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。