甘草與厚樸復配物對變異鏈球菌及生物膜形成的抑制作用

蔡昀盈， 吳夢琪， 夏 瑋， 宋金星， 張文清

（華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

甘草是豆科植物，屬多年生草本，是一種補益中草藥，種類以光果甘草（Glycyrrhiza glabra）和烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）為代表，甘草中含量較高的有效成分[1]主要分為皂苷類、黃酮類、異黃酮類、查耳酮類和香豆素類化合物，表現(xiàn)為抗菌、抗感染、抗?jié)兗翱鼓[瘤[2]等活性。

厚樸是木蘭科、木蘭屬植物，化學成分復雜，以木脂素及其衍生物為主，其中厚樸酚（Magnolol）與和厚樸酚（Honokiol）的含量最高。諸多研究表明，厚樸酚與和厚樸酚[3]具有促進腸胃蠕動、緩解焦慮、抗菌[4]、抗炎、抗腫瘤等功能，對心腦血管疾病等有一定的療效。

齲病是一種慢性疾病，細菌定植于牙面過程中，牙面的牙菌斑內(nèi)部多種細菌協(xié)調(diào)共生形成細菌群，這種群體稱為生物膜[5]。早期采用抗生素治療齲病和抑制生物膜形成雖有一定效果，但長期使用易引起耐藥和菌群失調(diào)而誘發(fā)其他疾病，故中草藥及其活性成分的抗齲和抑制生物膜形成效果引起了人們的關注。

近年來的研究表明，甘草中的某些活性化合物對與口腔感染相關的多種疾病具有明確的治療效果。例如，甘草次酸[6]對口腔念珠菌病和牙周組織病有明顯的療愈作用，可降低口腔疾病的發(fā)病頻率。紫檀烯類物質(zhì)甘草莖醇A 已被證實對齲病有明顯的抑制作用[1]，它對鏈球菌的抑菌情況極好。研究發(fā)現(xiàn)，厚樸中的厚樸酚及和厚樸酚[7]對致齲菌變異鏈球菌有很強的抑制作用。但目前，甘草和厚樸針對口腔疾病的研究[8]大多集中于有效成分的篩選和抑菌情況的測定，兩者復配效果及其對牙齒上生物膜形成的抑制功效鮮見研究。

本文考察了甘草和厚樸的乙醇提取物對常見致齲菌變異鏈球菌的抑菌活性，以及醇提物復配后的抑菌效果、對乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase, LDH）活性的影響和生物膜形成的抑制作用，為甘草和厚樸的復配物能夠應用于防齲功效型口腔膏提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 原料與試劑

烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch），購于康美藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)自內(nèi)蒙古；厚樸（Magnolia officinalis），購于康美藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)自四川；茶多酚，試劑級，天津希恩思生化科技有限公司；乙醇、氯化鈉，均為分析純，上海科化實驗器材有限公司；乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；結晶紫，分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；pH=7.4 磷酸鹽緩沖液，上海麥克林生化科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂，生物試劑，北京三藥科技開發(fā)公司；腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基（Brain Heaet Infusion， BHI），生物試劑，Oxiod CM225。

1.2 儀器

EA104 分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S24 電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；SYQ-DSX-280B 手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Thermo Scientific1029厭氧培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；THZ-98AB 恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗菌種

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，SM，UA159），購自Microbiologics 公司。

2 實驗方法

2.1 甘草和厚樸提取物的制備

甘草與厚樸藥材分別在40 ℃烘干，過60 目（250 μm）篩子。稱取20 g 中草藥粉，按料液比1∶8（g/mL）加入純乙醇[9-14]作為提取劑，經(jīng)55 ℃、1.5 h水浴回流提取，趁熱過濾，再加入相同體積提取劑，在100 Hz、55 ℃條件下超聲20 min，過濾合并兩次濾液，旋蒸、濃縮、冷凍、干燥，得到甘草乙醇提取物（G-EA）和厚樸乙醇提取物（M-EA），置于4 ℃冰箱中備用。

2.2 菌懸液的制備

用接種環(huán)取保存于?80 ℃的變異鏈球菌菌種適量，以“Z”字形輕輕地均勻涂布在已消毒滅菌的BHI 瓊脂固體培養(yǎng)基上，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，待平板上長出淡黃色鏈球菌[15]，用滅菌的接種環(huán)取單菌落置于10 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，取適量培養(yǎng)液與BHI 液體培養(yǎng)基以1∶19 的體積比混合，配制成5%（體積分數(shù)）的變異鏈球菌混合液，再于37 ℃下厭氧培養(yǎng)15 h，即得1×108CFU/mL 的菌液，備用。

2.3 抑菌活性測定

采用牛津杯法測定提取物的抑菌活性[16]。取菌懸液加至已滅菌的BHI 固體培養(yǎng)基中并搖勻，使最終菌濃度約為106CFU/mL。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，在超凈臺中冷卻至完全凝固，放置適量直徑為9 mm的牛津杯，選用純乙醇作溶劑，采用倍半稀釋法配制一系列質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 g/L 的G-EA和M-EA，以及兩者以質(zhì)量比1∶1 復配成的甘草-厚樸復配物（G-M1∶1），向牛津杯中加入200 μL 待測樣品，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，用十字交叉法測定抑菌圈直徑，以“x ± s（平均值±標準差）”表示數(shù)據(jù)。以純乙醇為空白對照，重復3 次平行實驗。

2.4 最小抑菌濃度（MIC）測定

用牛津杯法測定最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）[17]。將甘草提取物用純乙醇進行逐級稀釋，配制最終質(zhì)量濃度為4.60、2.30 、1.15、0.58 g/L 的樣品；將厚樸提取物用純乙醇進行逐級稀釋，配制最終質(zhì)量濃度為2.20、1.10、0.55 、0.28 g/L 的樣品。將備用的質(zhì)量濃度為108CFU/mL的變異鏈球菌菌懸液與BHI 培養(yǎng)基以1∶999 體積比混合，在超凈臺中冷卻至完全凝固，放置適量牛津杯，注入200 μL 樣品，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h。以溶劑為空白對照，重復3 次平行實驗。

2.5 聯(lián)合藥敏試驗

采用棋盤法在培養(yǎng)皿中進行聯(lián)合藥敏試驗[18]，如圖1 所示。用純乙醇溶解G-EA，配制濃度為2 MIC，逐級稀釋至最終濃度為1/32 MIC，從最右列開始往左分別加藥；用純乙醇溶解M-EA，配制濃度為2 MIC，逐級稀釋至最終濃度為1/32 MIC，從最上排開始向下分別加藥，加藥時按1∶1 質(zhì)量比取甘草和厚樸提取物溶液。將108CFU/mL 菌懸液與BHI 培養(yǎng)基以1∶999體積比混合，在超凈臺中冷卻至完全凝固，放置于適量牛津杯中，注入200 μL 混合液，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況。重復3 次平行實驗。

圖1瓊脂棋盤稀釋法簡易示意圖Fig.1Schematic diagram of simplified checkerboard testing technique

2.6 不同質(zhì)量比的甘草和厚樸提取物復配

G-EA 和M-EA 按照不同質(zhì)量比（m（G-EA）∶m（M-EA）＝3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）進行復配，分別得到5 種甘草與厚樸復配物G-M3∶1，GM2∶1，G-M1∶1，G-M1∶2，G-M1∶3，將每種復配物逐級稀釋，使其最終總質(zhì)量濃度分別為2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 g/L，測定不同質(zhì)量比復配物的MIC。

2.7 G-M1∶2 對變異鏈球菌生長的影響

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的變異鏈球菌菌懸液，調(diào)節(jié)至約107CFU/mL。茶葉中的茶多酚是天然防齲物質(zhì)[19-21]，具有抑菌作用和防齲效果，故選擇茶多酚作為陽性實驗材料。準備3 份2 mL 菌懸液與18 mL 已滅菌的BHI 液體培養(yǎng)基[18]的混合液，一份加入3.2 mg G-M1∶2使其最終質(zhì)量濃度為0.5 MIC，另一份加入3.2 mg 茶多酚作陽性對照試驗，最后一份不加任何抑菌物質(zhì)作為空白對照組。在37 ℃的恒溫振蕩器中厭氧培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h 時刻通過平板計數(shù)法測定菌濃度，繪制變異鏈球菌生長曲線。重復3 次平行實驗。

2.8 G-M1∶2 對變異鏈球菌中乳酸脫氫酶LDH 的活性影響

用消毒滅菌的BHI 液體培養(yǎng)基作為溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為0.16 g/L（1/2 MIC）、0.08 g/L（1/4 MIC）和0.04 g/L（1/8 MIC）的G-M1∶2溶液。設置消毒滅菌的BHI 液體培養(yǎng)基(不含任何藥物)作為對照組。每組實驗設置3 個平行管[22]。

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌懸液，調(diào)節(jié)至約107CFU/mL，取1 mL 菌懸液加入10 mL 不同質(zhì)量濃度的G-M1∶2培養(yǎng)基溶液中，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)18 h。收集細菌混合液到離心管內(nèi)，離心后棄上清液，按照細菌數(shù)量與提取液體積的比例為5×106∶1（即500 萬細菌加入1 mL 提取液）加入提取液。超聲破碎細菌（冰浴，功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復30 次）；在8000r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液，置冰上待測[23]。取100 μL 丙酮酸鈉標準溶液（2 μmol/mL），倍比稀釋得濃度為1、0.5、0.25、0.125、0 μmol/mL 的系列溶液。

按照乳酸脫氫酶活性測試試劑盒說明書進行操作，充分混勻，室溫下靜置3 min，取200 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔板，用酶標儀在450 nm 下測定吸光度（OD），記錄不同濃度標準管的吸光度；記錄測定管、對照管的吸光度（每個測定管需要設一個對照管），計算△OD=OD測定管?OD對照管。將計算得到的△OD 代入丙酮酸鈉標準溶液回歸方程中的x，計算y 值，即為樣品中丙酮酸的含量。

細菌中LDH 活力的計算公式如下：

式中：Vsample為反應體系中加入的樣本體積，10 μL；VNAD為加入的提取液體積，1 mL；t 為反應時間，15 min。每1 萬個細菌每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

2.9 G-M1∶2 對變異鏈球菌生物膜形成的抑制作用

鑒于四氟乙烯磁性攪拌子表面光滑，側(cè)面有棱，形狀和表面特性似牙齒，故選用與牙齒大小相似的直徑為5 mm、長度為10 mm 的攪拌子模擬牙齒。

取6 個長度為10 mm、直徑為5 mm 的磁性攪拌子模擬牙齒[15]，在無菌水中煮沸、滅菌、冷卻后風干，放入1.5 mL 離心管中。準備適量唾液，在4 ℃，6000r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，用0.22 μm 水相無菌濾頭過濾，取上清液，在每個1.5 mL 離心管中加入400 μL唾液上清液，在室溫下振蕩孵育4 h。

取出磁性攪拌子，在0.01 mol/L、pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）中輕輕刷洗2～3 次，待其風干后放入24 孔板，加入1.6 mL BHI 培養(yǎng)液、200 μL變異鏈球菌液（108CFU/mL）和400 μL 不同質(zhì)量濃度(1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 g/L)的G-M1∶2水溶液，此為藥物組。以無菌水取代G-M1∶2水溶液，此為對照組。將24 孔板放至37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h。

24 h 后取出磁性攪拌子，在PBS 中輕輕刷洗2～3 次，待其風干后放入干凈的24 孔板，加入2 mL、w=0.1%結晶紫溶液，染色15 min，取出磁性攪拌子，在PBS 中輕輕刷洗至表面只余少量結晶紫，待其風干后放至1.5 mL 離心管中，加入350 μL 無水乙醇，浸沒15 min；放置渦旋振蕩儀上高速旋轉(zhuǎn)，取出磁性攪拌子，轉(zhuǎn)移200 μL 液體至96 孔板，在570 nm 波長下用酶標儀測OD 值。

以上實驗平行做3 次。

DOU Hong-wei, WANG Guo-wei, CHEN Liang, LI Pan, KAN Tong, QIN Yong-wen

3 結果與討論

3.1 甘草和厚樸提取物對變異鏈球菌的抑菌效果

如圖2 所示，當質(zhì)量濃度為0.5 g/L 時，G-EA 和M-EA 的抑菌圈直徑為9 mm，與牛津杯外徑保持一致，說明牛津杯外無抑菌區(qū)域，故0.5 g/L 的G-EA 和M-EA 無抑菌性。當質(zhì)量濃度增加至1 g/L 時，M-EA抑菌圈直徑為（11.4±0.3）mm，直徑大于牛津杯外徑，開始出現(xiàn)抑菌性，相同質(zhì)量濃度下G-EA 抑菌圈直徑為9 mm，仍無抑菌性。當質(zhì)量濃度增加至2 g/L 時，G-EA開始出現(xiàn)抑菌性，證明M-EA 抑菌性略優(yōu)于G-EA。

圖2厚樸、甘草的提取物和復配物的抑菌效果Fig.2Inhibitory effects of different extracts and compounds of Glycyrrhiza uralensis Fisch and Magnolia officinalis

將相同質(zhì)量濃度的G-EA、M-EA 和1∶1 復配得到的復配物G-M1∶1進行抑菌活性比較，結果表明相同質(zhì)量濃度下，G-M1∶1對變異鏈球菌的抑菌圈直徑均大于單獨使用的G-EA 和M-EA，證明復配物抑菌性更佳。

3.2 甘草和厚樸提取物的協(xié)同作用

MIC 能直觀反映抑制細菌生長的最低質(zhì)量濃度。實驗測得G-EA 和M-EA 單獨對變異鏈球菌抑菌的MIC 分別為1.15 g/L 和0.55 g/L，證明兩種提取物均具有良好的抑菌活性?？瞻讓φ站w生長良好。

對G-EA 和M-EA 這兩種提取物進行體外聯(lián)合藥敏試驗，按照2.5 節(jié)中的棋盤法讀取無菌生長的最低濃度點，由此點對應的X 和Y 軸濃度分別為MICa和MICb，表示G-EA 與M-EA 復配時各自的MIC 值。而G-EA 和M-EA 單獨抑菌時的MIC 值記為A 和B，通過部分抑菌濃度指數(shù)（Fractional Inhibitor Concentration，F(xiàn)IC）的計算判斷提取物間的相互作用結果，公式如下：

當FIC<1 時，G-EA 和M-EA 之間為協(xié)同作用；當FIC＝1 時，G-EA 和M-EA 之間為相加作用；當12 時，G-EA 和M-EA 之間為拮抗作用。

通過計算FIC 值可評估兩種物質(zhì)之間的相互關系。由表1 可知，G-EA 與M-EA 復配時G-EA 的MIC為0.288 g/L, M-EA 的MIC 為0.069 g/L；G-EA 和MEA 單獨抑菌時MIC 分別為1.15 g/L 和0.55 g/L，即A 和B 分別為1.15 g/L 和0.55 g/L。通過FIC 的計算公式可得G-EA 和M-EA 對變異鏈球菌的FIC 值為0.375，F(xiàn)IC 小于1 證明G-EA 和M-EA 之間具有協(xié)同作用。

表1G-EA 和M-EA 聯(lián)合藥敏試驗的MICTable1MIC of G-EA and M-EA in FIC test

表2 所示為甘草和厚樸質(zhì)量比不同時復配物的MIC。由表2 可知，G-EA 和M-EA 的質(zhì)量比為1∶2時得到的復配物對變異鏈球菌的MIC 最小，為0.32 g/L。故綜合來看，復配時G-EA 和M-EA 的最佳質(zhì)量比為1∶2。

表2甘草和厚樸質(zhì)量比不同時復配物的MICTable2MIC of different mass ratios of G-EA and M-EA

3.3 G-M1∶2 對變異鏈球菌生長的影響

為了研究G-M1∶2對變異鏈球菌生長周期的影響，考察了質(zhì)量濃度為1/2 MIC（0.16 g/L）時的G-M1∶2和相同濃度的茶多酚對變異鏈球菌的生長抑制曲線，初步說明其主要抑制階段。如圖3 所示，0～3 h 是細菌的對數(shù)生長期，空白組細菌快速增殖，藥物組和陽性對照組中細菌也有增殖，但生長速度明顯低于空白組，說明G-M1∶2和茶多酚能有效抑制細菌生長；3～24 h 是細菌生長的穩(wěn)定期，空白組中細菌數(shù)量緩慢增長，藥物組和陽性對照組中細菌數(shù)量逐漸下降，證明在后期G-M1∶2和茶多酚也能很好地抑制細菌生長，但0.16 g/L 的G-M1∶2對變異鏈球菌的抑菌效果明顯優(yōu)于0.16 g/L 茶多酚對照組。

圖3G-M1∶2 和茶多酚對變異鏈球菌的生長抑制曲線Fig.3Effects of G-M1∶2 and tea polyphenol on the growth of Streptococcus mutans

3.4 G-M1∶2 對變異鏈球菌中乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響

乳酸脫氫酶由ldh 基因編碼，是參加糖代謝的關鍵酶。當變異鏈球菌與外源性糖接觸時，丙酮酸在LDH 的催化下反應生成乳酸，乳酸腐蝕牙齒引起牙釉質(zhì)脫礦，最終致齲[24]。因此LDH 在齲齒的防治上有重要的意義，如果能降低LDH 活性，就可有效抑制牙齒菌斑上乳酸的產(chǎn)生和釉質(zhì)的脫礦，從而達到防齲的目的。

在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與吸光物質(zhì)的濃度成正比，故以丙酮酸標準溶液濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標作圖，標準曲線如圖4 所示，得到標準曲線的回歸方程為y=5.668 3x?0.0296(R2=0.999)。

圖4丙酮酸標準溶液曲線Fig.4Standard curve of pyruvic acid

將實驗數(shù)據(jù)OD 值結合公式（1）和標準曲線方程進行計算后得到LDH 活性，如表3 所示，與空白組相比，G-M1∶2藥物組能有效抑制變異鏈球菌中乳酸脫氫酶(LDH)的活性，且隨著G-M1∶2質(zhì)量濃度由0.04 g/L (1/8MIC)增大至0.16 g/L(1/2MIC)，LDH 酶活性持續(xù)減弱。

表3G-M1∶2 對變異鏈球菌中乳酸脫氫酶活性的影響Table3Effects of G-M1∶2 to LDH of Streptococcus mutans

3.5 G-M1∶2 對變異鏈球菌生物膜形成的抑制作用

口腔細菌通過特定的分子作用附著到牙釉質(zhì)上，形成牙獲得性膜，在外源性糖的作用下慢慢形成牙菌斑生物膜，內(nèi)源性細菌如變異鏈球菌與生物膜內(nèi)的微生物相互作用，在多種致病因素的驅(qū)使下生物膜生態(tài)開始失衡，細菌開始對牙齒周圍組織造成侵害，引發(fā)各類口腔疾病，如齲病和牙周炎。同時產(chǎn)生弱有機酸代謝物，導致局部pH 值下降，最終引起牙齒脫礦導致齲病[25]。因此有效抑制生物膜形成、抑制致病菌對于防齲治齲具有重要意義。

生物膜抑制率等于對照組與藥物組吸光度的差值除以對照組的吸光度，圖5 示出了根據(jù)實驗數(shù)據(jù)及上述計算得到的不同質(zhì)量濃度G-M1∶2抑制生物膜形成的情況。如圖所示，G-M1∶2質(zhì)量濃度越高，抑制生物膜形成的能力越強，當G-M1∶2質(zhì)量濃度為MIC即0.32 g/L 時，仍可抑制61.70%的生物膜形成，而在G-M1∶2質(zhì)量濃度低于MIC 時仍然具有較強的生物膜抑制率。抑制50%及以上生物膜形成的G-M1∶2最低質(zhì)量濃度(MBIC50)為0.08 g/L(1/4 MIC)。目前控制牙菌斑生物膜的主要方法是外用和內(nèi)服藥物，如使用氟化物和抗生素清除生物膜以達到保護牙釉質(zhì)的目的，但長期使用容易產(chǎn)生耐藥性[5]，中草藥與上述藥物相比在生物安全性和持續(xù)抑菌效能上具有優(yōu)勢，在防齲治齲產(chǎn)品市場具有巨大潛力。

圖5G-M1∶2 對變異鏈球菌生物膜清除效果Fig.5Clearing effects of G-M1∶2 to the biofilm formed by Streptococcus mutans

4 結 論

考察了甘草和厚樸的乙醇提取物的抑菌性，比較了G-EA、M-EA 和G-M1∶1復配物對變異鏈球菌的抑菌效果，結果顯示復配物的抑菌性優(yōu)于單獨使用的G-EA 和M-EA。

通過牛津杯法分別測定甘草和厚樸提取物對變異鏈球菌的最小抑菌濃度和兩種提取物之間的相互作用關系。結果顯示G-EA 和M-EA 聯(lián)合使用時的FIC<1，具有協(xié)同作用，當兩者的質(zhì)量比為1∶2 時，復配物的抑菌效果最佳，G-M1∶2對試驗菌的MIC 值為0.32 g/L。通過生長抑制曲線探究G-M1∶2復配物對變異鏈球菌的抑菌時期，結果顯示其主要抑制發(fā)生在對數(shù)生長期及穩(wěn)定期，且G-M1∶2抑菌性能優(yōu)于同濃度的茶多酚的抑菌性能。

探究了G-M1∶2對變異鏈球菌中LDH 的活性影響和牙齒表面生物膜的抑制作用，結果顯示G-M1∶2能有效抑制LDH 的活性和生物膜的形成，其中對生物膜的MBIC50為0.08 g/L。

綜上所述，甘草與厚樸乙醇提取物對變異鏈球菌的抑菌能力和抑制生物膜形成的能力較強，復配物G-M1∶2的抑菌能力優(yōu)于兩種中草藥單獨使用和同濃度下茶多酚的抑菌能力。說明中草藥與目前常見的防齲治齲藥物相比在生物安全性和持續(xù)抑菌效能上具有優(yōu)勢，在防齲治齲產(chǎn)品市場具有巨大潛力。