pH/光雙敏感含偶氮苯聚合物分子的設(shè)計(jì)及藥物載體的應(yīng)用

劉天奇， 雷 彬， 徐首紅， 劉洪來(lái)

（華東理工大學(xué)上海多級(jí)結(jié)構(gòu)納米材料工程技術(shù)研究中心，化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

為了實(shí)現(xiàn)藥物的靶向輸送和可控釋放，各種能夠響應(yīng)環(huán)境刺激如pH[15-16]、溫度[17-18]、光[19-20]、氧化還原電位[21-22]、超聲波[23-24]、酶[25]等的刺激響應(yīng)型聚合物膠束被不斷發(fā)展起來(lái)。由于腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致糖酵解和乳酸積累，使腫瘤部位具有不同于正常組織的pH 值，如相比于正常的組織環(huán)境（pH=7.2～7.4），腫瘤組織的pH 為6.4 左右，并且腫瘤細(xì)胞內(nèi)從早期核內(nèi)體（pH=6.0～6.5），晚期核內(nèi)體（pH=5.0～6.0）到溶酶體（pH=4.5～5.0）也存在著pH 梯度變化，所以pH 刺激常被作為設(shè)計(jì)刺激響應(yīng)型藥物載體的內(nèi)源刺激[26-28]。聚甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯（PDPA）就是能夠響應(yīng)pH 刺激的聚合物，在不同的pH 環(huán)境下能夠發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化，從而使親疏水性發(fā)生改變。光是一種非接觸式的外源刺激，波長(zhǎng)和強(qiáng)度都能夠被遠(yuǎn)程控制，也常被應(yīng)用于藥物載體的設(shè)計(jì)中。偶氮苯（AZO）是光響應(yīng)型的官能團(tuán)，偶氮苯分子存在順式和反式兩種異構(gòu)體，在紫外或可見(jiàn)光照射下能夠發(fā)生可逆的光異構(gòu)化反應(yīng)，從而引起空間結(jié)構(gòu)或親疏水性的變化[29-32]。

多重刺激響應(yīng)型聚合物能夠?qū)煞N或多種刺激敏感，能夠適應(yīng)腫瘤部位復(fù)雜的生理環(huán)境，在癌癥的藥物遞送和治療中顯示出了巨大的潛能。本文設(shè)計(jì)、合成了3 種具有不同聚合度的pH 和光雙重敏感的聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-聚乙二醇（PEG45）（n=30,50,80），并探究聚合物的雙重敏感性以及聚合物形成的膠束的基本性質(zhì)，進(jìn)而篩選出適合腫瘤部位藥物遞送的聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-PEG45，研究此聚合物包載抗癌藥物阿霉素的體外釋放行為以及其生物相容性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯（DPA，w=98%，百靈威科技有限公司）；聚乙二醇單甲醚(mPEG2000,w=98%，百靈威科技有限公司)；2-溴代異丁酰溴(w=98%,百靈威科技有限公司); N,N,N',N″,N″-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA, 分析純,上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)；CuBr(分析純，經(jīng)冰醋酸、乙醇洗滌3 次,干燥后待用)；芘（w=99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 鹽酸型阿霉素（DOX·HCl，w=98%，百靈威科技有限公司）；四氫呋喃（THF，分析純，上海泰坦試劑有限公司，使用前重蒸除水）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二氯甲烷(分析純, 上海泰坦試劑有限公司，使用前經(jīng)氫化鈣處理)；中性三氧化二鋁（200～300 目（75～48 μm），上海蓮花有限公司），堿性三氧化二鋁（200～300 目（75～48 μm），上海蓮花有限公司）；人肝癌細(xì)胞株（Huh7 細(xì)胞，美國(guó)菌種保藏ATCC），人腎上皮細(xì)胞系（HEK-293T，美國(guó)菌種保藏ATCC），細(xì)胞毒性試劑盒（CCK-8, 日本同仁化學(xué)研究所）、無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM, 美國(guó)Gibco 公司)、熱滅活胎牛血清（FBS, 美國(guó)Gibco 公司）。

動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS, Zetasizer Nano ZS90，英國(guó)馬爾文公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2450，日本島津公司）；熒光分光光度計(jì)（F-4500，日本日立公司）；凝膠滲透色譜儀（GPC，PL-GPC50，英國(guó)馬爾文公司）；透射電子顯微鏡（TEM，JEM-1400，日本電子株式會(huì)社）；核磁共振測(cè)定儀(NMR, AVANCEⅢ 500，德國(guó) Bruker 公司)；倒置顯微鏡（EVOS x1，美國(guó)AMG公司）；熒光顯微鏡（EVOS FL，美國(guó)AMG 公司）；微孔板分光光度計(jì)（xMark Microplate Spectrophotometer，美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 分子引發(fā)劑C10-AZO-C10-OBr 的合成

在干燥的單口燒瓶中加入0.4211g C10-AZOC10-OH（8.6×10?4mol），用14 mL 二氯甲烷溶解，在冰水浴攪拌的條件下用注射器逐滴加入300 μL 三乙胺和300 μL 2-溴異丁酰溴，停止冰水浴，避光室溫反應(yīng)30 h。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入少量活性炭，攪拌30 min 進(jìn)行抽濾，濾餅用二氯甲烷沖洗3 遍，取濾液，用旋蒸法除去其中的二氯甲烷溶劑，得到黃色黏稠狀產(chǎn)物。

1.3 C10-AZO-C10-PDPAn-Br 的合成

通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）聚合的方法接枝聚合物。以C10-AZO-C10-OBr 作為引發(fā)劑，PMDETA作為配體，CuBr 作為催化劑，用MgSO4處理過(guò)的CH2Cl2作為溶劑，按照物質(zhì)的量之比n(DPA)∶n(C10-AZOC10-OBr)∶n(CuBr)∶n(PMDETA)=m∶1∶1∶1.1（ m=30、50、80，合成3 種PDPA 鏈長(zhǎng)不同的聚合物）的比例將藥品分別放入Schlenk 瓶中，加6 mL 溶劑CH2Cl2。經(jīng)過(guò)3 次液氮冷凍-抽真空-溶解，在冷凍、氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下加催化劑CuBr，于室溫避光條件下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，通入空氣，無(wú)水無(wú)氧體系被破壞，反應(yīng)停止，此時(shí)溶液呈深綠色。將反應(yīng)液通過(guò)裝有中性氧化鋁的柱子，用THF 作洗脫液除去CuBr。通過(guò)旋蒸和在冷凍的無(wú)水甲醇中沉降的方法除去溶劑以及未反應(yīng)的單體DPA、配體PMDETA，收集產(chǎn)物，得黃色黏稠狀聚合物，通過(guò)1H-NMR 以及 GPC 檢測(cè)產(chǎn)物純度。

1.4 C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 的合成

首先將1.00 g mPEG45溶解在10 mL 新蒸的THF中，在冰水浴條件下，加入0.04 gNaH 并反應(yīng)3 h，活化PEG 中的羥基，再加入新蒸的THF 溶解的C10-AZO-C10-PDPAn-Br，室溫避光反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)完全后旋蒸，無(wú)水甲醇沉降3 次，得到黃色黏稠狀產(chǎn)物。用1H-NMR 確定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，用GPC 檢測(cè)聚合物的相對(duì)分子量（Mn）和分布系數(shù)（PDI）

毛澤東同志說(shuō)，正確的政治路線確定之后，干部就是決定的因素。在高等教育大變革和大發(fā)展的態(tài)勢(shì)之下，地方高校怎樣抓住“黃金發(fā)展期”，將改革與發(fā)展推上一個(gè)新的高度，刻不容緩地?cái)[在了各級(jí)各類地方高校的黨委面前。筆者認(rèn)為從中觀層面入手，就是要選好用好中層領(lǐng)導(dǎo)干部，以此為抓手，不斷提升地方高校的核心競(jìng)爭(zhēng)力。

1.5 嵌段聚合物的物性表征

1.5.1 聚合物pH 敏感點(diǎn)的測(cè)定 配制質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，pH 3.0 的酸性聚合物溶液C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）。用一定濃度的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH，用DLS 和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液在不同pH 下的電位、透射率的變化，以電位或透射率值為縱坐標(biāo)，pH 值為橫坐標(biāo)作圖。

1.5.2 聚合物光敏感性的測(cè)定 配制質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，pH 3.0 的酸性聚合物溶液C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80），置于紫外分光光度計(jì)的比色皿中，用365 nm 的紫外光每隔5 s 或10 s 照射（至曲線不再變化），然后再用470 nm 的可見(jiàn)光照射至曲線不再發(fā)生變化，在此過(guò)程中實(shí)時(shí)檢測(cè)溶液的紫外吸收值。

以芘作為熒光探針測(cè)定聚合物在水溶液中的臨界膠束濃度（CMC）。首先配制芘在水中的飽和溶液，然后把一定量的C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的THF溶液置于玻璃試管中，用吹風(fēng)機(jī)使THF 揮發(fā)干凈，然后加入2 mL 芘的飽和溶液，使聚合物芘溶液的初始質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，接下來(lái)用芘飽和溶液不斷稀釋，在此過(guò)程中，設(shè)定熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)為334 nm，檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的聚合物芘溶液在373 nm以及384 nm 處的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度比值（I373/I384）為縱坐標(biāo)，聚合物芘溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，其突變點(diǎn)即為CMC 值。

1.6 聚合物膠束的制備

使用溶劑揮發(fā)法制備聚合物膠束。首先配制6 mg/mL 的聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的THF 溶液，取100 μL 到棕色小瓶中，在攪拌下逐滴加入2 mL、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（1 mmol/L），繼續(xù)攪拌12 h，使溶液中的THF 揮干，得到質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL 的膠束溶液。對(duì)于載藥的聚合物膠束，在把聚合物的THF 溶液轉(zhuǎn)移到棕色小瓶后，加入鹽酸型阿霉素（DOX·HCl）和適量三乙胺，攪拌1 h，使親水性鹽酸型阿霉素轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷腄OX，以便包載在膠束的疏水核中，再逐滴加入pH 7.4 的PBS 緩沖溶液，使藥物的最終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，繼續(xù)攪拌12 h，用分子截留量為14000g/mol的透析袋透析除去未被包載的DOX。所形成聚合物膠束的粒徑、電位用DLS 表征，形貌特征用TEM 表征。檢測(cè)包裹在膠束中的DOX 在480 nm 處的吸收值，得到DOX的包載量（DLC）及包封率（DLE）。公式如下：

其中：mB1為膠束中的藥物質(zhì)量，mg；mC1為總膠束質(zhì)量，mg；mC2為總藥物質(zhì)量，mg。

1.7 C10-AzO-C10-PDPA30-mPEG45 膠束的藥物釋放

把8mL 包 載 DOX 的 C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45膠束溶液分別取1 mL 裝入6 個(gè)透析袋中，然后分別放入裝有25 mL PBS 緩沖液（pH 分別為5.0、6.4、7.4）的兩組離心管中，其中一組預(yù)先用365 nm的紫外光照射60 s，之后把兩組離心管一起放入恒溫振蕩箱中振蕩，每隔一定時(shí)間用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定離心管中緩沖液在480 nm處的紫外吸收值，從而確定藥物釋放量。8 mL 中剩余的2 mL 膠束溶液加入HCl 溶液解離，用以測(cè)定膠束中包載的總藥量。DOX 累計(jì)釋放量以I1/I2×100%表示，其中：I1為不同時(shí)間膠束中釋放出DOX 的紫外吸收強(qiáng)度；I2為膠束包載的總DOX 的紫外吸收強(qiáng)度。

1.8 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)

人肝癌細(xì)胞系Huh7 和人腎上皮細(xì)胞系HEK-293T 均來(lái)自于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，這兩款細(xì)胞都在DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中同時(shí)加入100 U/mL青霉素、100 U/mL 硫酸鏈霉素和10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS，并將細(xì)胞放在37 ℃、含5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

空膠束的細(xì)胞毒性：在96 孔板上接種人肝癌細(xì)胞系Huh7 或人腎上皮細(xì)胞系HEK-293T 細(xì)胞（104個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)過(guò)夜。然后加入不同質(zhì)量濃度的空膠束（7.5～225 μg/mL），共孵育8 h 后換成新鮮培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)16 h，在每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8 中的試劑，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 嵌段聚合物的合成及表征

嵌段聚合物的合成路線如圖1 所示。首先用C10-AZO-C10-OH 和2-溴異丁酰溴反應(yīng)合成C10-AZOC10-OBr，然后將其作為引發(fā)劑，用ATRP 法合成聚合物C10-AZO-C10-PDPAn（n=30,50,80），最后接枝親水性的mPEG2000，得到具有pH 和光雙重敏感的兩親性聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）。

每一步合成產(chǎn)物的1H-NMR 如圖2 所示，圖中(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ) 分 別 為C10-AZO-C10-OBr，C10-AZOC10-PDPAn和C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45的1H-NMR譜圖。(Ⅰ)中a 處對(duì)應(yīng)于AZO 上苯環(huán)的特征峰，b（δ=1.96）處的峰歸屬于Br?C?（CH3）2上的質(zhì)子。(Ⅱ)中 c（δ=1.01）處的強(qiáng)峰歸屬于異丙基的甲基質(zhì)子，是PDPAn的特征峰，表明了PDPAn的成功連接。(Ⅲ)中d（δ=3.63）處出現(xiàn)了mPEG45中重復(fù)單元?CH2CH2O?上質(zhì)子的特征峰，說(shuō)明mPEG45的成功修飾。綜上，說(shuō)明成功制備了嵌段聚合物。

圖1嵌段聚合物合成路線Fig.1Synthesis route of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 block copolymer

圖2(Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr、(Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn 和(Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 在CDCl3 中的1H-NMR 譜圖Fig.21H-NMR spectra of (Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr, (Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn and (Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 in CDCl3

同時(shí)，GPC 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明了嵌段聚合物的成功合成。表1 列出了合成聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的組成、數(shù)均分子量和分散系數(shù)（PDI）。從表1 可以看到，隨著PDPA 聚合度的增加，數(shù)均分子量增大。聚合物的PDI 值偏大，可能是合成聚合物時(shí)，存在少量未反應(yīng)的C10-AZO-C10-PDPAn-OBr，且不溶于無(wú)水甲醇，導(dǎo)致PDI 偏大。

通過(guò)測(cè)定嵌段聚合物在不同pH 環(huán)境下的透射率和電位的變化來(lái)確定pH 敏感點(diǎn)，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)pH<5.5 時(shí)，嵌段聚合物溶液澄清透明，透過(guò)率近乎100%；隨著NaOH 溶液的滴加，PDPA 逐漸開(kāi)始脫質(zhì)子化，由親水性變成疏水性，溶液逐漸變得渾濁，從而確定pH 敏感點(diǎn)。如圖3（a）所示，pH 敏感點(diǎn)為6.3～7.2，且隨著PDPA 聚合度的增加，嵌段聚合物的pH 敏感點(diǎn)略有增大。這可能是因?yàn)镻DPA 鏈段越長(zhǎng)，其從親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷愿鼮槔щy，需要更多的OH?用以脫質(zhì)子化。另一方面，隨著pH 的升高，Zeta電位開(kāi)始下降，這是由于在pH<5.5 時(shí)，存在大量H+，因而溶液為正電性；隨著NaOH 的量逐漸增多，電位由正轉(zhuǎn)為負(fù)（如圖3（b）所示）。Zeta 電位的結(jié)果和透過(guò)率法測(cè)出的嵌段聚合物pH 敏感點(diǎn)基本一致。

表1C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 共聚物的分子量和分散系數(shù)Table1Molecular weight and dispersity index(PDI) of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 copolymers

嵌段聚合物的光敏感性可以通過(guò)測(cè)定聚合物溶液在不同光照下的紫外吸收值來(lái)確定。其中偶氮苯以反式（trans-）構(gòu)型存在，在350 nm 處有一個(gè)強(qiáng)的特征吸收峰，順式（cis-）偶氮苯在440 nm 處有較強(qiáng)的吸收峰。從圖4（a）、4（c）、4（e）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，當(dāng)用365 nm 的紫外光照射0.3 mg/mL 的各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80; pH=3）溶液時(shí)，隨著光照時(shí)間的增加，350 nm 處的紫外吸收值逐漸減小，440 nm 處的峰值略有增高，反式構(gòu)型的AZO 逐步向順式構(gòu)型轉(zhuǎn)變，當(dāng)光照時(shí)間約為20 s 以上時(shí)，紫外吸收曲線均不再發(fā)生變化，說(shuō)明反式偶氮苯向順式偶氮苯轉(zhuǎn)化已達(dá)到平衡。之后再用470 nm 的可見(jiàn)光照射，結(jié)果如圖4（b）、4（d）、4（f）所示，在350 nm左右處的吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，440 nm 處的吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱，順式構(gòu)型的AZO 逐步向反式構(gòu)型轉(zhuǎn)變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 種聚合物在可見(jiàn)光分別照射5、10、35 s之后，順式偶氮苯又向反式偶氮苯轉(zhuǎn)化并且達(dá)到平衡，其中，C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45反異構(gòu)化速度最快，表明連接較大尺寸的聚合物可能會(huì)阻礙反異構(gòu)化的進(jìn)行。同時(shí)，與紫外光照前相比，光照后350 nm處的吸收值有所降低，440 nm 處的吸收值略有升高，表明偶氮苯不能完全回復(fù)到紫外光照前的狀態(tài)，這可能是由于PDPA 嵌段對(duì)AZO 基團(tuán)的異構(gòu)化具有一定的阻礙作用[33]。以上結(jié)果說(shuō)明聚合物具有可逆的光敏感性。

2.2 嵌段聚合物膠束的物性

CMC 值是嵌段聚合物形成膠束最基本的物性參數(shù)。本文利用芘作為熒光探針，測(cè)得各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的CMC值分別為1×10?1、1×10?2、1×10?2mg/mL（圖5（a）），且隨著PDPA 聚合度的增加而減小。這可能是由于PDPA 鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)，形成膠束時(shí)疏水聚集能力越強(qiáng)，越容易形成膠束，因此CMC 值越小。通過(guò)DLS、TEM表征所形成膠束的粒徑以及形貌，結(jié)果如圖5（b）、5（c）所示，可見(jiàn)各聚合物形成球狀且粒徑分布均勻的膠束，PDPA 聚合度為30、50、80 的聚合物膠束平均直徑分別在140、200、220 nm 左右。在pH=7.4 的PBS（1 mmol/L）緩沖液中，嵌段聚合物所形成膠束的平均直徑隨著PDPA 聚合度的增加而增大。原因可能在于PDPA 疏水嵌段越長(zhǎng)，所形成膠束疏水內(nèi)核越大，膠束直徑就越大。通過(guò)TEM 所觀察到的粒徑大小和DLS 的測(cè)定結(jié)果基本一致。

2.3 聚合物膠束的體外模擬釋藥

圖3不同pH 環(huán)境下聚合物膠束溶液的（a）透射率及（b）Zeta 電位的變化（聚合物膠束溶液質(zhì)量濃度0.1 mg/mL）Fig.3(a) Transmittance and (b) Zeta potential of polymeric micelle solution in different pH environments(Mass concentration of copolymeric micelle solution: 0.1 mg/mL)

圖4反式 (a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10–AZO-C10-PDPA80-mPEG45 受到不同時(shí)間紫外光（365 nm）照射后的紫外吸收譜圖; 順式 (b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45,(f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45 受不同時(shí)間可見(jiàn)光（470 nm）照射后的紫外吸收譜圖Fig.4Ultraviolet absorption spectra after irradiation of ultraviolet (365 nm) after different time intervals of trans-(a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45; Ultraviolet absorption spectra after irradiation of visible light (470 nm) after different time intervals of cis-(b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45,(f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45

人體正常生理環(huán)境的pH 約為7.4，腫瘤微環(huán)境為弱酸性，pH 約為6.5，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的pH 更低，約為5.5～6.5[34]。本文選取了pH 敏感點(diǎn)為6.3 左右的嵌段聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45制備膠束，作為抗癌藥物DOX 的載體進(jìn)行體外模擬釋藥，載藥量為12.1%±1%。

選取pH 為5.0、6.4 和7.4 這3 種pH 環(huán)境進(jìn)行藥物釋放研究。DOX 的釋藥結(jié)果如圖6 所示，累計(jì)釋藥量隨著環(huán)境pH 值的降低而增大。在pH=7.4 時(shí)，25 h 后的累計(jì)釋藥量約為11.3%±4%，說(shuō)明在人體正常生理環(huán)境下，聚合物膠束能夠有效地包載DOX，藥物泄漏量少。在pH=6.4 和pH=5.0 條件下，相應(yīng)的DOX 最終平衡累計(jì)釋藥量分別約為59.6%±5%，81.0%±5%。這是因?yàn)槿芤核嵝栽綇?qiáng)，聚合物PDPA 嵌段越容易發(fā)生質(zhì)子化，從疏水性逐漸變成親水性嵌段，引起膠束結(jié)構(gòu)動(dòng)搖從而釋放包裹在膠束疏水層內(nèi)的DOX。

圖5(a)聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的臨界膠束濃度隨熒光強(qiáng)度比值I373/I384 變化曲線（pH=7.4）；(b)聚合物膠束的粒徑分布圖（pH=7.4）；(c) 聚合物膠束的透射電鏡圖（pH=7.4）Fig.5(a) Florescence intensity ratio (I373/I384) versus logarithm of critical micelles concentrations（ C10-AZO-C10-PDPAnmPEG45（n=30,50,80））; (b) Size distribution of the copolymer micelles; (c) Transmission electron micrographs of copolymer micelles(pH=7.4)

圖6聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 在不同pH 和紫外光照射條件下的累計(jì)釋放曲線Fig.6Accumulated release curves of C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 in different pH under irradiation of UV light

同時(shí)，考察了紫外光刺激后的釋藥效果。在開(kāi)始釋藥前，用365 nm 的紫外光照射各個(gè)pH 下的載藥樣品，發(fā)現(xiàn)其釋藥率都增加了約10%左右。這是因?yàn)椴糠质杷訢OX 包裹在C10-AZO-C10嵌段所形成的疏水層中，紫外光照使AZO 由反式構(gòu)象變?yōu)轫樖綐?gòu)象，導(dǎo)致膠束的疏水層發(fā)生擾動(dòng)，促進(jìn)了DOX 的釋放。

2.4 聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 空白膠束的細(xì)胞毒性

為了檢測(cè)聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45膠束本身的生物相容性，分別用人肝癌細(xì)胞系Huh7和人腎上皮細(xì)胞系HEK-293T 與不同質(zhì)量濃度的C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45膠束共孵育8 h，然后換成新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)孵育16 h，用細(xì)胞毒性試劑盒（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，與不同質(zhì)量濃度的空白膠束作用后這兩個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞存活率依然很高，即使空白膠束質(zhì)量濃度高達(dá)225 μg/mL，Huh7 和HEK-293T 細(xì)胞的存活率仍保持在90%以上，這說(shuō)明聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45膠束無(wú)論是對(duì)肝癌細(xì)胞還是對(duì)正常細(xì)胞其毒性都極小，表明此聚合物膠束具有良好的生物相容性，適合作為藥物載體。

圖7不同質(zhì)量濃度的聚合物空白膠束對(duì)Huh7 和 HEK-293T 的細(xì)胞毒性Fig.7Cytotoxicity to Huh7 and HEK-293T cells at different mass concentrations of copolymer micelle

3 結(jié) 論

（1）利用腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了同時(shí)具有pH 響應(yīng)和紫外光響應(yīng)的嵌段共聚物，通過(guò)自組裝過(guò)程制備pH/光可控釋藥載體。

（2）首先測(cè)得了各聚合物C10-AZO-C10-PDPAnmPEG45（n=30,50,80）的各項(xiàng)物理化學(xué)性質(zhì)，其CMC 值分別1×10?1、1×10?2、1×10?2mg/mL，而 其粒徑也在140～220 nm之間，滿足EPR 效應(yīng)的基本要求。

（3）嵌段聚合物在不同pH 環(huán)境下表現(xiàn)出不同的親、疏水性，且受到聚合物嵌段長(zhǎng)度的影響而具有不同的pH 敏感點(diǎn)，其敏感點(diǎn)在6.3～7.2 之間。

（4）通過(guò)對(duì)嵌段聚合物的紫外光響應(yīng)性能考察，證實(shí)了AZO 基團(tuán)的順?lè)唇Y(jié)構(gòu)可以在365 nm 的紫外光和470 nm 的可見(jiàn)光照射下發(fā)生可逆轉(zhuǎn)換，照射下具有良好的光響應(yīng)性能。

（5）驗(yàn)證了聚合物在水相中具有優(yōu)良的pH/光雙敏感可控性，通過(guò)照射可使原先pH 敏感的聚合物膠束的釋藥率提高10%左右，而細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明所獲得的聚合物膠束不論是在低質(zhì)量濃度（7.5 μg/mL）下還是在較高質(zhì)量濃度（225 μg/mL）下都有較高的生物相容性，可以預(yù)見(jiàn)該pH/光雙敏感的聚合物膠束在靶向藥物載體研制領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。