C-myc基因重排的套細胞淋巴瘤臨床病理分析

鄒宗楷，沈洪武，何惠端，楊偉平，紀思靈

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院病理科，漳州 363000）

套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma MCL）約占非霍奇金淋巴瘤（NHL）5%～6%，以老年男性為主，發(fā)現(xiàn)時多為III/IV期病變。近年來，化療聯(lián)合利妥昔單抗等治療使患者的預(yù)后顯著提高，但部分患者復(fù)發(fā)并最終死亡。MCL病因及發(fā)病機制仍不清楚，帶有基因表達和深度測序的分子譜分析發(fā)現(xiàn)其存在細胞周期、DNA損傷反應(yīng)、增殖和凋亡途徑的基因組和表觀遺傳學(xué)異常[1]。C-myc是一種原癌基因，定位于8q24區(qū)，編碼核蛋白轉(zhuǎn)錄因子C-myc。Cmyc主要通過易位、重組擴增方式活化，在細胞增殖及凋亡方面有重要的生物學(xué)功能[2]。目前，在C-myc相關(guān)淋巴瘤的研究主要集中在伯基特淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）。據(jù)報道[3，4]，C-myc在發(fā)病率較低的MCL中重排發(fā)生率1.46%～7.97%，在母細胞樣/多形性變異型中高達16.50%～18.18%。C-myc在MCL中臨床意義的研究較少，本研究通過免疫組織化學(xué)及FISH方法分析C-myc基因易位與MCL組織學(xué)分型、乳酸脫氫酶（LDH）水平、Ki-67指數(shù)、KPS評分、Ann Arbor分期等臨床病理因素的相關(guān)性，闡述C-myc表達情況及其重要臨床意義，以此提高病理及臨床對MCL的診治新認識。

材料和方法

1 材料來源

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院2010年12月至2015年12月間明確診斷的40例MCL病理蠟塊。其中男性28例、女性12例，年齡34～84歲，中位數(shù)年齡66歲。標本部位：淺表淋巴結(jié)28例，胃腸道8例，膽囊、脾各1例，鼻咽、扁桃體各1例。其中經(jīng)典型28例、母細胞型11例、多形性型1例。以40例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎組織作為陰性對照。標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。收集完整臨床病理資料（如年齡、性別、分期、類型、預(yù)后等）。病理評估由兩位病理醫(yī)師依據(jù)2016版WHO造血和淋巴組織腫瘤分類標準明確診斷。該項目同時被漳州市醫(yī)院倫理審查委員會批準。

2 主要試劑與儀器

BenchMarkXT全自動免疫組織化學(xué)染色儀（羅氏公司，美國），Olympus BX51型熒光顯微鏡（日本），Leica原位雜交儀（ThermoBrite，德國）；C-myc基因雙色斷裂分離重組探針（橙色探針277kb chr8:128432540-128709819，綠色探針407kb chr8:130338931-130745615）由北京金菩嘉技術(shù)有限公司提供；兔抗人C-myc單克隆抗體（RMA-0664即用型）、抗Ki-67抗體購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。胃蛋白酶為Sigma產(chǎn)品。

3 C-myc、Ki-67免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定

嚴格按照試劑盒和儀器說明書進行免疫組織化學(xué)檢測，用PBS替代一抗作為空白對照，以人伯基特淋巴瘤組織在每張切片中設(shè)陽性對照；染色后蘇木素復(fù)染。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：C-myc主要表達于細胞核，陽性呈棕褐色、棕黃色或淺黃色。參考Vander免疫組織化學(xué)判讀標準，隨機選擇10個高倍視野中陽性細胞在同類型細胞中的百分比的平均值作為整張切片的判讀結(jié)果，C-myc以腫瘤細胞數(shù)≥20%為陽性。Ki-67陽性定位于細胞核，陽性呈黃褐色，隨機選擇10個高倍視野，計算每個視野內(nèi)腫瘤組織中陽性細胞的百分率(%)，以平均值作為Ki-67增殖指數(shù)。

4 C-myc基因易位FISH檢測及結(jié)果判讀

采用3 μm石蠟組織切片進行直接法FISH檢測。嚴格按照試劑盒和儀器說明書進行技術(shù)操作，包括石蠟樣本玻片預(yù)處理、雜交儀自動變性雜交、玻片洗滌、DAPI復(fù)染、結(jié)果觀察等。Alexa Flour555標記的橙色探針識別C-myc基因著絲粒（119kb)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的綠色探針識別C-myc基因端粒（1.5Mb）并結(jié)合斷裂點的端粒，三色濾光鏡下觀察間期細胞熒光雜交信號，F(xiàn)ISH圖像分析軟件進行圖像采集、分析和保存。結(jié)果判定：按照說明書要求，首先建立本實驗室閾值。FISH信號根據(jù)2名實驗員分別計數(shù)200個細胞信號檢出，陽性Cutoff值（正常對照的平均值+3個標準差）來自40例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)標本。確定本實驗室C-myc探針易位陽性閾值為12%，擴增陽性閾值為15%。正常細胞C-myc基因顯示為2個由紅色和綠色熒光融合的黃色信號，C-myc基因易位重排細胞顯示1紅1綠1黃信號，≥3個黃色信號判斷為C-myc基因擴增，且2個分離信號間的距離≥3倍信號直徑。每張切片上加一反應(yīng)性淋巴結(jié)組織作為陰性對照。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，C-myc和Ki67相關(guān)性采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 套細胞淋巴瘤組織病理學(xué)特征

病理切片HE染色顯示：與對照組比較，淋巴結(jié)性MCL淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞，瘤細胞彌漫增生。MCL常見組織學(xué)類型有3種類型：①經(jīng)典型淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞，瘤細胞中等偏小，彌漫增生，形態(tài)相對單一，胞質(zhì)少，核略不規(guī)則，少見核分裂（圖1A）；②母細胞樣型瘤細胞類似淋巴母細胞，核形不規(guī)則、染色質(zhì)細，核分裂多見（圖1B）；③多形型瘤細胞大小不一，可見較大型瘤細胞，核不規(guī)則、多個小核仁，核分裂易見（圖1C）。

2 套細胞淋巴瘤中C-myc表達和Ki-67指數(shù)增高

MCL中C-myc在腫瘤組織中免疫反應(yīng)陽性細胞的百分率≥20%有5例（12.5%），4例為母細胞型，1例為多形型，C-myc在腫瘤組織中免疫反應(yīng)陽性細胞的百分率分別為1例25%、2例30%、1例40%、1例50%；對照組40例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎組織均無C-myc陽性表達，MCL中C-myc免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)顯著高于對照組（表1）。C-myc陽性細胞核主要呈棕褐色、棕黃色或淺黃色（圖1D）；而C-myc陰性細胞核呈淡藍色（圖1E）。12例母細胞型/多形性型Ki-67指數(shù)均≥60%（圖1F），對照組Ki-67指數(shù)均＜20%，呈黃褐色。全部MCL病例均cyclin D1陽性。

表1 C-myc蛋白和基因在套細胞淋巴瘤中的免疫組織化學(xué)表達Tab. 2 Expression of C-myc protein and gene in mantle cell lymphoma

3 套細胞淋巴瘤中C-myc基因重排易位

40例MCL中，檢測出C-myc基因易位3例（7.5%）（圖1G），均為母細胞型，信號值分別為12% 、13% 和14%，均有C-myc蛋白陽性表達。C-myc蛋白表達陰性組中無C-myc基因易位的病例（圖1H），MCL中C-myc蛋白表達與C-myc基因易位顯著高于對照組。3例C-myc基因易位的Ki-67指數(shù)分別為60%、70% 、80%，無基因易位的套細胞淋巴瘤Ki-67指數(shù)均＜35%。

圖1 套細胞淋巴瘤HE 染色與免疫組織化學(xué)、FISH檢測。A，經(jīng)典型套細胞淋巴瘤HE染色；B，母細胞樣型套細胞淋巴瘤HE染色；C，多形型套細胞淋巴瘤HE染色；D，母細胞型套細胞淋巴瘤C-myc蛋白免疫組織化學(xué)染色陽性；陽性率30%；E，經(jīng)典型套細胞淋巴瘤C-myc免疫組織化學(xué)染色陰性；F，母細胞型套細胞淋巴瘤Ki-67免疫組織化學(xué)染色，指數(shù)60%；G，經(jīng)典型套細胞淋巴瘤C-myc FISH染色，示無C-myc基因易位病例細胞核內(nèi)為2個由紅色和綠色熒光融合的黃色信號（箭頭）；H，母細胞型套細胞淋巴瘤C-myc FISH染色，示有C-myc基因易位病例細胞核內(nèi)可見1個紅色信號、1個綠色信號和1個紅綠混合的黃色信號（箭頭）；比例尺，50μmFig. 1 HE staining， immunohistochemistry staining and FISH examination of mantle cell lymphoma. A， classical type: the diffuse proliferation of tumor cells destroys the structure of normal lymph nodes. The tumor cell morphology is relatively single. Most cases are composed of small to medium sized lymphoid cells with less cytoplasm， slightly irregular nuclei and fewly mitosis; B， blast-like cells type: tumor cells are similar to lymphoblasts with irregular nuclear membrane， fine chromatin， and more mitosis; C， pleomorphic type: the tumors are composed of cells vary in size. Some larger tumor cells are present in this case with irregular nuclei， multiple small nucleoli and more mitosis; D， 30% expression of C-myc protein in blast-like cells type. Fully automatic IHC staining; E， negative expression of C-myc protein in classical type. Fully automatic IHC staining; F， 60% expression of Ki-67 index in blast-like cells type. Fully automatic IHC staining; G， A case of classical type without C-myc gene translocation shows two yellow signals formed by a mixture of the red and green fluorescence signals in the nucleus (arrow)， FISH method; H， the cases of blast-like cells type with positively gene translocation of C-myc showed one red signal， one green signal and one yellow signal formed by a mixture of the red and green signals in the nucleus(red arrow)， FISH method; scale bar， 50μm.

4 套細胞淋巴瘤患者C-myc基因易位與臨床病例特征的關(guān)系

MCL中，C-myc基因易位與年齡、性別、臨床分期無明顯相關(guān)，而與組織學(xué)母細胞型/多形型分型、LDH水平升高、Ki-67指數(shù)≥60%、KPS評分低于90明顯正相關(guān)（表2）。

表2 套細胞淋巴瘤患者C-myc基因易位臨床病理學(xué)意義Tab. 2 Clinical significance of C-myc gene translocation in patients with mantle cell lymphoma

5 3例C-myc基因重排易位的套細胞淋巴瘤臨床特征

3例C-myc基因易位者在性別、年齡、體能狀況、受累區(qū)域、LDH水平、Ann Arbor分期及治療效果等臨床病理因素均表現(xiàn)為高級別B細胞淋巴瘤的征象，對治療反應(yīng)差，僅部分緩解，預(yù)后不良（表3）。

表3 3例C-myc基因重排的MCL臨床資料Tab.3 Clinical characteristic s of three cases of MCL with C-myc gene rearrangement

討 論

導(dǎo)致細胞周期蛋白D1（cyclin D1）過表達的染色體異位t(11; 14)(q13; q32)始終存在于MCL中，但是繼發(fā)性細胞遺傳學(xué)改變，如基因重排、二次染色體畸變也非常普遍。MCL中C-myc存在不同程度的異常，包括基因易位和擴增，與預(yù)后不良有關(guān)[4]。與許多其他癌基因中發(fā)現(xiàn)的體細胞突變或融合蛋白相反，C-myc失調(diào)是通過失去對C-myc表達的嚴格控制而導(dǎo)致淋巴瘤形成。

本組病例，3例母細胞樣型FISH檢測到C-myc基因重排，占所有病例7.5%、占母細胞樣/多形性MCL組25%，對比文獻報道[34]，數(shù)值偏高，且Cmyc基因易位與性別和年齡、臨床分期無顯著相關(guān)性、淋巴瘤組和對照組均無基因擴增，可能與病例數(shù)較少或地區(qū)、人群差異有關(guān)。3例C-myc基因易位者表現(xiàn)為高級別B細胞淋巴瘤的臨床征象，且組織學(xué)分型、LDH水平、Ki-67指數(shù)、KPS評分與基因重排易位的相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義，符合有關(guān)文獻報道[3，4]。

B細胞淋巴瘤中C-myc失調(diào)是伯基特淋巴瘤的主要事件，其次是侵襲性淋巴瘤，如DLBCL，在低度惡性B細胞淋巴瘤中，C-myc重排通常會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化為高侵襲性淋巴瘤[5]。近年來，國內(nèi)學(xué)者[6]通過免疫組織化學(xué)及RT-PCR研究C-myc在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤患者預(yù)后評估中的意義，證實C-myc蛋白表達及基因異常與臨床分期、IPI相關(guān)，可作為判斷預(yù)后的指標。

Hao[7]等FISH分析5例MCL的復(fù)雜核型，提示涉及C-myc基因的8q24異常是罕見的繼發(fā)性異常，與母細胞樣/多形性變異型的形態(tài)學(xué)特征有關(guān)，也與淋巴瘤性白血病侵襲有關(guān)。Setoodeh[8]報告4例C-myc易位或擴增的MCL，具有侵略性并顯示出高Ki67指數(shù)。陳偉偉[9]等FISH檢測50例伴外周血及骨髓侵犯的MCL患者p53、C-myc/8q24等多種基因異常，顯示18例伴有C-myc獲得，提示Cmyc異常是獨立預(yù)后不良因素。Choe[10]等收集65例MCL患者，C-myc蛋白表達陽性4例，占所有病例6.15%，占母細胞樣/多形性型36.36%，2例發(fā)現(xiàn)基因重排，均為高C-myc表達的母細胞樣變異型，占所有病例3.07%，占母細胞樣/多形性型18.18%，Ki-67和p53表達明顯更高，無進展生存期和總體生存期均顯著縮短。Hu[4]在17例母細胞樣/多形性型MCL發(fā)現(xiàn)具有C-myc重排的MCL符合晚期疾病、侵略性特征、Ki-67指數(shù)高、p53表達、復(fù)雜核型和預(yù)后不良的特點，據(jù)此提出“雙重打擊”淋巴瘤的思路。如前所述，本實驗組3例基因重排的MCL均屬母細胞型，也符合2016版WHO淋巴組織腫瘤分類[11]“雙重打擊”高級別B細胞淋巴瘤（HGBL）的總體概念。

Chisholm[3]等評估包含1214個淋巴瘤的組織微陣列，其中138例MCL的C-myc蛋白染色水平＞25%者占2.1%，F(xiàn)ISH基因檢查時，11例出現(xiàn)基因異常占7.97%，提示以25%為C-myc蛋白陽性閾值，似乎偏高，不能敏感性反映基因異常。Choe[10]等通過ROC曲線確定20% C-myc蛋白水平為影響患者生存的有意義閾值。Horn[12]等建議C-myc蛋白表達以20%為界，有助于確定存在C-myc基因重排且低水平蛋白表達的淋巴瘤。本實驗組C-myc蛋白以著色腫瘤細胞數(shù)≥20%為陽性閾值，顯示出基因重排和免疫組織化學(xué)較高的一致性。

Lee[13]等報道C-myc基因在MCL中結(jié)構(gòu)異常且蛋白過表達，是MCL對依魯替尼的內(nèi)在抗性基礎(chǔ)，作為HSP90的受體蛋白，C-myc可通過PU-H71抑制，以克服原發(fā)性依魯替尼耐藥性。本實驗組2例患者治療方案為R+伊布替尼和R+DHAP，部分緩解，但生存時間較短，分別為28和35個月，目前對“雙重打擊”HGBL的治療研究中顯示使用R-EPOCH和RHyper-CVAD的方案可能對預(yù)后會有更好的效果[14，15]。

C-myc基因重排的MCL是一組獨特類型疾病，多為母細胞樣或多形性變異型，具有Ki-67指數(shù)高和C-myc蛋白過表達特點。C-myc重排可傳達重要的預(yù)后信息，臨床上應(yīng)該將具有高級別形態(tài)特點且C-myc蛋白陽性率≥20%的MCL進行FISH檢測，以明確有無C-myc基因重排易位，將其結(jié)果納入病理報告中，有助于全面的病理診斷并協(xié)助臨床進行有效化療或精準靶向用藥。