外泌體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)對(duì)眼部疾病的作用及治療應(yīng)用

李映雪，付燕，童瑤，楊路*

（1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科；2寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科，寧波 315000）

外泌體（exosome）是一類通過細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體（endosome），隨后在轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體及一些相關(guān)蛋白的調(diào)控下出芽形成多囊泡體（multivesicular bodies， MVB），經(jīng)外膜與細(xì)胞膜融合后，繼而分泌到胞外的脂質(zhì)雙分子層小囊泡，直徑30～150nm，屬于細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）的一種[1]。在細(xì)胞分泌后，外泌體可充當(dāng)細(xì)胞信號(hào)的媒介，將其“貨物”—mRNA或miRNA等輸送到受體細(xì)胞中，參與細(xì)胞間遺傳信息的傳遞與基因表達(dá)的調(diào)控。除參與細(xì)胞間通訊外，外泌體還具有調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡、免疫應(yīng)答、細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換、干細(xì)胞分裂或分化、新生血管和細(xì)胞廢物去除等作用[2]。近年來，隨著對(duì)各種細(xì)胞分泌的外泌體深入探究，發(fā)現(xiàn)外泌體可應(yīng)用于疾病的早期診斷、藥物的遞送及疾病的治療等多方面[3]。在眼科方面，已發(fā)現(xiàn)外泌體可用于治療視神經(jīng)擠壓傷、青光眼、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜激光損傷、自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病[4]。外泌體作用的多樣性是由于，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化或周圍的細(xì)胞狀態(tài)影響其成分組成時(shí)，可釋放具有獨(dú)特成分的不同外泌體亞群[5]，可利用差異表達(dá)的蛋白或其它因子從而對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用。下面概述幾種不同的細(xì)胞在不同環(huán)境條件下分泌的外泌體的作用與功能。

1 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來源的外泌體及功能

視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium， RPE）是一種分隔脈絡(luò)膜和光感受器的單細(xì)胞層，在視覺穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。由于其解剖位置的特殊性，RPE容易受到氧化應(yīng)激造成細(xì)胞損傷，特別是活性氧（ROS）的刺激。

1.1 RPE源性外泌體誘導(dǎo)新生血管產(chǎn)生

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可使RPE細(xì)胞分泌的外泌體增多，內(nèi)皮細(xì)胞在外泌體的影響下成管能力增加，眼底新血管形成因此加速。新生血管廣泛生長(zhǎng)且自身無收縮止血功能，因此視網(wǎng)膜內(nèi)非常容易出血，進(jìn)而發(fā)展出現(xiàn)纖維增生，引起玻璃體積血、視網(wǎng)膜增殖、牽拉性視網(wǎng)膜脫離等，是導(dǎo)致患者視力急劇下降，最終失明的主要原因。因此新生血管是致盲性疾病，如濕性老年性黃斑變性（age-related macular degeneration， AMD）和糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）最常見的標(biāo)志之一。有研究表明，外泌體無論在體外和體內(nèi)都具有獨(dú)立的血管生成活性，在探究其促進(jìn)新生血管產(chǎn)生的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，受氧化應(yīng)激刺激的人視網(wǎng)膜色素上皮（ARPE-19）細(xì)胞的外泌體中血管生成因子受體(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)的表達(dá)顯著升高，并包裹額外的miRNAs[6]。關(guān)于miRNAs對(duì)新生血管的影響，有研究表明miR-543富集的外泌體可顯著誘導(dǎo)受體RPE細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[7]，發(fā)生EMT的RPE細(xì)胞所分泌的外泌體較正常RPE細(xì)胞分泌的外泌體含有更多的血管生成因子，且miR-543、miR-10a-5p和miR-323a-3p的水平顯著提高，由此加重EMT循環(huán)。此外異常miR-155的遞送也可使ARPE-19細(xì)胞促血管生成[8]。但外泌體也并不僅僅是形成新血管的幫兇，如脊索細(xì)胞分泌的外泌體可將高表達(dá)的miRNA-140-5p轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞并調(diào)節(jié)下游Wnt/β-catenin通路來抑制血管生成[9]，也可產(chǎn)生治療作用。

1.2 RPE源性外泌體參與免疫調(diào)節(jié)

除了通過miRNAs誘導(dǎo)新生血管，外泌體作為目前最具特征的細(xì)胞外囊泡（EVs），也因其體外和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性而聞名，且其免疫調(diào)節(jié)潛力與細(xì)胞來源無關(guān)[10]。因此在探究RPE細(xì)胞中具有的多種免疫特性時(shí)， Knickelbein等[11]認(rèn)為細(xì)胞分泌的EVs可能是這些免疫調(diào)節(jié)功能的中介，通過證明發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞衍生的外泌體根據(jù)炎癥環(huán)境差異調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)和單核細(xì)胞表型。當(dāng)在穩(wěn)態(tài)條件下分泌的外泌體可促進(jìn)人單核細(xì)胞CD14+CD16+的免疫調(diào)節(jié)表型增加；在受炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ和TNFα等的刺激下外泌體可誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子的上調(diào)和單核細(xì)胞死亡，由此可以看出細(xì)胞周圍環(huán)境的變化會(huì)改變其分泌的外泌體的免疫活性。此外，補(bǔ)體系統(tǒng)作為先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分，細(xì)胞可通過補(bǔ)體因子H（complement factor H， CFH）或通過CD46和CD59等細(xì)胞膜分子，來保護(hù)自己免受過度的補(bǔ)體激活，但有研究發(fā)現(xiàn)在AMD中CD46和CD59減少[12]。Ebrahimi等[13]發(fā)現(xiàn)這是由于AMD中Bruch膜中存在的氧化低密度脂蛋白（oxLDLs）的影響，使RPE細(xì)胞中的CD46和CD59通過在外泌體和凋亡顆粒中釋放而部分降低，從而使RPE細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷敏感。除了AMD，外泌體在干燥綜合征（sjogren syndrome， SS）干眼、角膜移植排斥反應(yīng)、自身免疫性葡萄膜炎等幾種眼睛疾病中也發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。

1.3 RPE源性外泌體抑制細(xì)胞凋亡

αB-晶狀體蛋白（αB-crystallin）被稱為細(xì)胞內(nèi)高爾基膜相關(guān)的小熱休克蛋白。Gangalum等發(fā)現(xiàn)αB-晶狀體蛋白通過外泌體從ARPE-19細(xì)胞分泌，而該蛋白又可通過內(nèi)吞途徑中的一個(gè)分支點(diǎn)對(duì)外泌體合成或分泌起調(diào)節(jié)作用[15]。αB-晶狀體蛋白是一種具有抗凋亡活性的伴侶蛋白，在保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激敏感性增加方面發(fā)揮重要作用。這是由于當(dāng)RPE細(xì)胞受到氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的刺激，會(huì)對(duì)外源性αB-晶狀體蛋白的攝取增加，并通過抑制Caspase-3和多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase， PARP）的激活來保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，從而在眼部起到神經(jīng)保護(hù)作用[16]。但由于αB-晶狀體蛋白體積小，達(dá)到治療效果需要一個(gè)巨大的釋放量，Wang等[17]將αB-晶狀體蛋白肽設(shè)計(jì)成蛋白質(zhì)聚合物納米顆粒，通過調(diào)節(jié)其流體力學(xué)半徑來增強(qiáng)效力。其他研究也同樣發(fā)現(xiàn)其納米囊化形式可以為各種視網(wǎng)膜退行性、炎癥和血管疾?。ㄈ鏏MD和DR）提供極大的治療優(yōu)勢(shì)[18]，且與其相互調(diào)節(jié)的外泌體或許是最好的形式[19]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體及功能

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新能力、分化可塑性、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)特性和免疫調(diào)節(jié)特性，是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面最有前途的外泌體細(xì)胞來源[20]。

2.1 MSC源性外泌體提供視神經(jīng)保護(hù)

多項(xiàng)研究已表明，MSC衍生外泌體在促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）神經(jīng)元的保護(hù)和再生方面已顯示出顯著的治療效果[21]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs） EVs甚至可作為一種有效的神經(jīng)保護(hù)療法，用于慢性高眼壓模型的治療。Mathew等[22]也研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都能接受EVs，因此在視網(wǎng)膜疾病神經(jīng)保護(hù)和再生治療方面十分有潛力。例如，在創(chuàng)傷性（視神經(jīng)擠壓傷）和退行性（青光眼）眼病中，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell， RGC）及其軸突的丟失是導(dǎo)致失明的主要原因之一，而Mead等[23]發(fā)現(xiàn)BMSC來源的外泌體可促進(jìn)RGC的存活和軸突的再生，同時(shí)防止RGC軸突丟失和RGC功能障礙；通過敲除關(guān)鍵的miRNA效應(yīng)分子Argonaute-2后發(fā)現(xiàn)外泌體依賴于miRNA在視網(wǎng)膜內(nèi)層發(fā)揮治療作用，其療效可通過損傷視網(wǎng)膜的信號(hào)如TNFα啟動(dòng)和增加PEDF及VEGF-AA水平進(jìn)一步提高[24]。

2.2 MSC源性外泌體減輕炎癥反應(yīng)

此外，MSCs可以抑制T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等的增殖和功能，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是治療自身免疫性和炎癥性疾病的潛在新藥物[25]。研究表明，MSC的免疫抑制作用主要?dú)w因于其衍生的細(xì)胞外囊泡（MSC-EVs）的影響，這是由于其抗炎作用主要靠MSC-EVs傳遞免疫細(xì)胞中的miRNAs和蛋白來完成，因此在局部和全身應(yīng)用MSC-EVs后能有效抑制炎癥組織的有害免疫反應(yīng)，促進(jìn)損傷實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存活和再生[26]。MSC-EVs不僅能抑制抗原提呈細(xì)胞的活化，抑制Th1和Th17細(xì)胞的發(fā)育[27]，還能抑制炎癥細(xì)胞的遷移[28]，因此可以對(duì)自身免疫性葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎性疾病中發(fā)揮治療作用。如Zhang等發(fā)現(xiàn)miR-126高表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體（MSC-Exos）可顯著降低高糖誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)和NLRP3炎癥小體在人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal endothelial cells， HRECs）中的活性，減輕高血糖所致的視網(wǎng)膜炎癥[29]；MSC-Exos玻璃體腔注射治療后，視網(wǎng)膜單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1明顯下調(diào)，促進(jìn)視網(wǎng)膜激光損傷的恢復(fù)[30]。而且有趣的是，只有在接受MSC衍生外泌體的動(dòng)物中才注意到炎癥減輕作用，在使用成纖維細(xì)胞衍生外泌體治療后沒有效果[31]，因此證實(shí)不同細(xì)胞來源的外泌體作用并不相同。

3 角膜細(xì)胞與睫狀體細(xì)胞來源的外泌體及功能

3.1 角膜細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)傷口愈合

角膜傷口的愈合需要經(jīng)過上皮細(xì)胞增殖和遷移、基質(zhì)細(xì)胞死亡、角膜細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞生成、膠原沉積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等多個(gè)過程[32]，因此角膜上皮與基質(zhì)間的相互作用對(duì)于角膜傷口的愈合來說尤為重要。而有研究發(fā)現(xiàn)能穿透厚厚的內(nèi)皮基質(zhì)膜（Descemet膜）的外泌體似乎是角膜上皮與基質(zhì)之間“溝通”的重要介質(zhì)。例如，Zieske等[33]發(fā)現(xiàn)從角膜上皮細(xì)胞中分離出的EVs可直接導(dǎo)致角膜細(xì)胞啟動(dòng)纖維化。并且Lai等[34]發(fā)現(xiàn)用血栓素-1（thrombospondin-1， TSP-1）處理的人角膜上皮細(xì)胞（human corneal epithelial cells， HCECs）中 分 離出的外泌體含有傷口愈合相關(guān)蛋白，這些外泌體被HCECs吸收后可促進(jìn)組織的重塑與修復(fù)。而角膜細(xì)胞中除了角膜上皮細(xì)胞外，研究發(fā)現(xiàn)人角膜間充質(zhì)干細(xì)胞也可以分泌外泌體并能加速角膜上皮傷口愈合[35]。例如，角膜基質(zhì)干細(xì)胞（corneal stromal stem cells， CSSC）的間充質(zhì)干細(xì)胞可防止角膜損傷后纖維瘢痕形成，刺激透明基質(zhì)組織的再生。Shojaati等[36]發(fā)現(xiàn)這是由于CSSC EVs與角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞迅速融合后，將miRNA轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而降低纖維基因Col3a1和Acta2的表達(dá)，阻斷中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而恢復(fù)正常組織形態(tài)；而當(dāng)減少EVs的miRNA時(shí)，對(duì)阻斷角膜瘢痕的形成無效。另外Wang 等[37]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生外泌體（iPSCs-Exos）可以增加HCECs的遷移和增殖，抑制多種損傷引起的細(xì)胞死亡，并且MSC-Exos治療角膜上皮缺損的療效強(qiáng)得多。多種發(fā)現(xiàn)均反映了外泌體等細(xì)胞外囊泡對(duì)于角膜傷口愈合的重要性。

3.2 非色素睫狀體上皮源性外泌體調(diào)節(jié)Wnt通路

眼壓的控制取決于主要由非色素睫狀體上皮（non-pigmented ciliary epithelium， NPCE）細(xì)胞產(chǎn)生的房水與其通過傳統(tǒng)和替代途徑流出之間的動(dòng)態(tài)平衡。而傳統(tǒng)流出途徑中，存在于小梁網(wǎng)狀細(xì)胞中典型Wnt信號(hào)通路，是房水流出和眼壓的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與青光眼的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[38]。Lerner 等[39]發(fā)現(xiàn)NPCE細(xì)胞分泌的外泌體通過下調(diào)GSKβ正調(diào)節(jié)因子AKT的表達(dá)和增加GSKβ負(fù)調(diào)節(jié)因子PP2A的水平，使GSK3β磷酸化減弱和β-catenin的胞質(zhì)水平降低，此外，Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子miR-29b在NPCE外泌體中也含量豐富，從而干擾 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使小梁網(wǎng)中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑，沉積到小梁網(wǎng)狀細(xì)胞的多孔結(jié)構(gòu)中，減少房水的流出，導(dǎo)致眼壓升高。有意思的是，Tabak 等[40]發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)相關(guān)蛋白的表達(dá)下調(diào)不僅與外泌體相關(guān)，而且與外泌體的濃度相關(guān)，只有在低濃度外泌體的刺激下才能有效調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此，NPCE衍生的外泌體參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路或許可以作為引流系統(tǒng)內(nèi)藥物干預(yù)的新靶點(diǎn)，即青光眼治療的靶點(diǎn)[41]。

4 外泌體未來在眼病中的應(yīng)用與展望

如前所述，外泌體與多種眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，雖然目前在眼病治療的研究方面還處于起步與探索階段，但從腫瘤與神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的研究中不難發(fā)現(xiàn)，外泌體在眼部疾病的早期診斷和治療中潛力巨大。

外泌體因其相對(duì)穩(wěn)固性，可以通過多種方法從淚液、房水、玻璃體液中獲取，又因包含組織、細(xì)胞或疾病特異性的蛋白質(zhì)和核酸，其在眼部疾病診斷方面的應(yīng)用前景頗為看好[42]。關(guān)于疾病治療，在角膜干細(xì)胞缺乏、角膜損傷等眼表疾病中，外泌體介導(dǎo)的旁分泌由于其無細(xì)胞性質(zhì)，可以規(guī)避干細(xì)胞移植的局限性和風(fēng)險(xiǎn)，減少自身免疫和排斥反應(yīng)，使外泌體通過基因修飾可獲得最佳的治療親和力[43]。此外，許多視力威脅性疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病影響眼睛的后段，由于眼睛的特殊解剖和生理，受血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)，為藥物輸送到視網(wǎng)膜提出了一個(gè)重大挑戰(zhàn)。而外泌體作為一種天然的納米藥物載體，具有與脂質(zhì)體相似的穿梭親脂性和親水性貨物的能力，能夠跨越血腦屏障[44]，將其包裹的分子傳遞到細(xì)胞膜上，并且與合成納米材料相比，不僅藥物清除率降低，在靶向、安全和藥代動(dòng)力學(xué)方面都顯示出實(shí)質(zhì)性的好處[45]。而目前，雖然外泌體的優(yōu)點(diǎn)已廣被熟知，但離實(shí)際的臨床應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)，外泌體存在的問題也需要多多被探究，以期望在未來發(fā)揮安全的治療效用。