miR-21-5p抑制缺氧誘導的肺動脈內(nèi)皮細胞損傷

崔艷紅，劉培培，孫潺

（南陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科二病區(qū)，南陽 473000）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種極具破壞性且能危及生命的疾病，其特征是肺血管阻力和肺動脈壓的持續(xù)增加，并導致右心功能障礙[1]。雖然已提出了許多假說，但目前PAH進展的具體調(diào)控機制仍不明確。近來研究表明，慢性缺氧是PAH患者血管重構(gòu)的重要刺激因素[2，3]，低氧誘導的肺動脈內(nèi)皮細胞（pulmonary artery endothelial cell，PAEC）損傷在PAH的血管重構(gòu)中發(fā)揮重大作用[4，5]。然而，影響PAEC損傷反應(yīng)中涉及的具體分子機制仍不完全清楚。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類長度約為21～23個核苷酸的小的非編碼單鏈RNA分子，其可通過與特定mRNA靶標的3’-非翻譯區(qū)（untranslation region，UTR）相互作用而在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)基因表達[6]。miRNAs在胚胎發(fā)育、細胞增殖、遷移、凋亡和免疫應(yīng)答等多種生物過程中起調(diào)節(jié)作用[6，7]。生物信息學預測表明30%以上的基因受miRNA調(diào)控[7]。在慢性缺氧和野百合堿誘導的PAH大鼠模型中，已經(jīng)明確指出眾多miRNAs參與調(diào)控PAH的進展[8]。miR-21-5p作為miRNAs的一員，其已被證明是包括腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞在內(nèi)的許多細胞類型的缺氧敏感性標記物[9，10]。目前，miR-21-5p在缺氧導致的PAEC損傷中的主要功能尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建缺氧刺激誘導的HPAEC損傷模型研究miR-21-5p的功能，并闡述其中涉及的分子機制。

材料和方法

1 主要試劑與材料

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司）；L-谷氨酰胺、內(nèi)皮細胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）、肝素鈉和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；miR-21-5p模擬物（miR-21-5p mimic）和miR-21-5p的陰性對照物（miR-NC）（上海萬生昊天生物技術(shù)有限公司）；Krüeppel樣因子6（Krüeppel-like factor 6，KLF6）過表達載體質(zhì)粒（pcDNA-KLF6）和對照載體質(zhì)粒（pcDNA-Con）（上海生工生物工程股份有限公司）；Hoechst 33342染液、Trizol試劑和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；Annexin V-FITC/PI試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Bradford法蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、兔抗GAPDH抗體、小鼠抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔或驢抗小鼠IgG (H+L)二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；小鼠抗Cleaved caspase-3和小鼠抗KLF6抗體（Santa Cruz Biotechnology公司）；原代人肺動脈內(nèi)皮細胞（HPAEC）（上海中喬新舟生物科技有限公司）。

2 細胞培養(yǎng)

原代HPAEC培養(yǎng)在含有20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/mL ECGS和20 μg/ml肝素鈉的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2的潮濕的細胞培養(yǎng)箱中。待細胞傳代至于第5～8代時用于后續(xù)實驗。

3 細胞缺氧處理

取第5～8代HPAEC至于Forma 3130型缺氧細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）（培養(yǎng)條件為37 °C、5% CO2、90% N2和5% O2）中分別培養(yǎng)12、24和48 h。

4 細胞轉(zhuǎn)染

取第5～8代HPAEC置于不含抗生素但含20%胎牛血清2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/ml ECGS和20 μg/mL肝素鈉的DMEM培養(yǎng)基中，待細胞生長至約70%～80%匯合時，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，用Lipofectamine 2000試劑分別將miR-NC、miR-21-5pmimic、pcDNA-Con和pcDNA-KLF6轉(zhuǎn)入HPAEC，孵育6 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

5 RT-qPCR

用Trizol試劑提取細胞總RNA，然后按照說明書步驟用FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒在SLAN-96P型實時熒光定量PCR系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）中進行反應(yīng)。引物序列為：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′（miR-21-5p正向引物）；5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(U6，正向引物)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ (U6，反向引物)。以U6作內(nèi)部對照，用2-ΔΔCt法計算其miR-21-5p相對表達量。

6 LDH活性檢測

將已轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-21-5p-mimic、miR-NC+ pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-KLF6的HPAEC分別接種于96孔板并至于常氧或缺氧條件培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL LDH釋放試劑并于37 °C下孵育1 h，用OSE-MP25型微孔板離心機（天根生化科技（北京）有限公司）以500 r/min離心5 min收集細胞的上清液。并按照試劑盒說明，將上清液重新加到一個新的96孔板中，各孔分別加入50 μL LDH檢測液，室溫避光孵育30 min，用SuPerMax 3000FA型酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）檢測450 nm處各孔光密度值以評估上清液中LDH的活性。

7 Hoechst染色

將已轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-21-5p-mimic的HPAE- C分別接種于96孔板并至于常氧或缺氧條件培養(yǎng)48 h后，將細胞用4%多聚甲醛固定，用5 μg/mL Hoechst 33342染料室溫避光染色15 min，然后用TS-2型熒光顯微鏡（Nikon，日本）觀察細胞核形態(tài)。

8 流式細胞術(shù)

將已轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-21-5p-mimic、miR-NC+ pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-KLF6的HPAEC分別接種于6孔板并置于常氧或缺氧條件培養(yǎng)48 h后，并按照試劑盒說明書，在室溫避光條件下分別孵育10 μL Annexin V-FITC和PI染液10 min，然后用EXFLOW-206型流式細胞儀（深圳市達科為生物技術(shù)股份有限公司）檢測細胞凋亡率。

9 Western blot

用RIPA提取HPAEC的蛋白，Bradford法對蛋白定量后，用SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜上蛋白用用5%（w/v）脫脂乳封閉后，室溫孵育1:1000稀釋的Cleaved caspase-3、KLF6和GAPDH或β-actin一抗2 h。用TBST洗膜后，室溫孵育1:1000稀釋的HRP偶聯(lián)山羊抗兔或驢抗小鼠IgG (H+L)二抗1 h。TBST再次洗膜后，用化學發(fā)光液對條帶顯影，并用Image J軟件通過光密度值測定法定量相對條帶表達豐度，并用內(nèi)參GAPDH或β-actin的條帶的光密度值進行標準化。

10 miR-21-5p靶基因的預測和鑒定

用TargetScanHuman 7.2（http://www.targetscan.org/vert_72/）預測miR-21-5p靶基因。構(gòu)建攜帶miR-21-5p靶基因KLF6的野生型（WT）或突變（MUT）3’-UTR的pmiRRB-report雙熒光素酶報告載體質(zhì)粒。用Lipofectamine 2000試劑分別將構(gòu)建的WT或MUT的雙熒光素酶報告載體質(zhì)粒和miR-21-5p mimic或miR-NC轉(zhuǎn)入細胞，并在轉(zhuǎn)染48 h后，在GloMaxTM 20/20型生物化學發(fā)光分析儀（美國Promega公司）上用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒測量熒光素酶活性。

11 統(tǒng)計學分析

結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組數(shù)據(jù)間均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析事后SNK-q檢驗。P＜0.05時，認為有統(tǒng)計差異。

結(jié) 果

1 缺氧導致HPAEC中miR-21-5p表達下調(diào)

首先探索miR-21-5p表達是否響應(yīng)缺氧條件。RT-qPCR檢測顯示，與常氧條件相比，缺氧條件下HPAEC中miR-21-5p表達降低，并且隨著缺氧時間的延長，miR-21-5p的表達水平逐漸降低。后續(xù)實驗選擇缺氧處理時間為48h。

圖1 HPAEC在常氧條件48 h或暴露于缺氧條件12、24和48 h，RT-qPCR檢測miR-21-5p的表達。與Normoxia組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與Hypoxia-12h組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與Hypoxia-24h組比較，&P＜0.05；n=3Fig. 1 The expression of miR-21-5p was detected by RT-qPCR after 48 h of normoxia condition or 12， 24 and 48 h of hypoxia exposure respectively. Compared with Normoxia group: *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001; compared with Hypoxia-12h group: #P＜0.05， ##P＜0.01; compared with Hypoxia-24h group: &P＜0.05; n=3

2 過表達miR-21-5p減輕缺氧誘導的HPAEC損傷

LDH活性檢測顯示，與常氧條件下的miR-NC組相比，缺氧條件下miR-NC組HPAEC的LDH的釋放活性明顯增加；與缺氧條件下的miR-NC組比較，缺氧條件下的miR-21-5p-mimic組HPAEC的LDH的釋放活性明顯降低，但仍高于常氧條件下的miR-NC組（圖2A）。Hoechst染色顯示，常氧條件下的miR-NC組HPAEC的細胞核正常，缺氧條件下的miR-NC組HPAEC的細胞核出現(xiàn)核固縮和凋亡熒光碎片，但miR-21-5p-mimic轉(zhuǎn)染可明顯減輕缺氧誘導的這些現(xiàn)象（圖2B）。流式細胞術(shù)檢測顯示，miR-21-5p-mimic轉(zhuǎn)染可明顯減少由缺氧誘導的HPAEC凋亡（圖2C、D）。此外Western blot檢測進一步證實，缺氧可導致HPAEC中Cleaved caspase-3升高，用miR-21-5p-mimic轉(zhuǎn)染可顯著抑制缺氧誘導的HPAEC中Cleaved caspase-3水平（圖2E、F）。

圖2 過表達miR-21-5p可減輕缺氧誘導的HPAEC損傷。A，LDH釋放水平；Hoechst染色（比例尺，20 μm）；C，凋亡率代表性流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；D，凋亡率統(tǒng)計學分析；E，Cleaved caspase-3水平的代表性Western blot檢測結(jié)果；F，Cleaved caspase-3水平統(tǒng)計學分析。與Normoxia+miR-NC組比較：*P＜0.05，***P＜0.001；與Hypoxia+miR-NC組比較：##P＜0.01；n=4。Fig. 2 Overexpression of miR-21-5p attenuated hypoxia-induced HPAEC injury. A， LDH release level of HPAEC in different treatment groups; B， Hoechst staining (scale bar， 20 μm); C， representative flow cytometry analysis of apoptosis rate; D， statistical analysis of the apoptosis rate; E， representative Western blot detection of Cleaved caspase-3 level; F， statistical analysis of Cleaved caspase-3 level. Compared with Normoxia + miR-NC group: *P＜0.05， ***P＜0.001; compared with Hypoxia + miR-NC group， ##P＜0.01; n=4

3 過表達KLF6抑制miR-21-5p對缺氧誘導的HPAEC損傷的保護作用

用TargetScanHuman 7.2軟件預測KLF6可能是miR-21-5p的靶基因，因此，本研究首先檢測了缺氧條件下HPAEC中KLF6水平。Western blot檢測顯示，與常氧條件比較，缺氧條件下HPAEC中KLF6蛋白表達明顯升高（圖3A、B）。對KLF6預測的與miR-21-5p具有結(jié)合位點的序列點突變（圖3C）后，熒光素酶報告基因分析顯示，miR-21-5p-mimic與KLF6 WT熒光報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染能降低熒光相對活性，而miR-21-5p-mimic與KLF6 MUT熒光報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對熒光相對活性無影響（圖3D）；且進一步通過Western blot證明miR-21-5p過表達能降低KLF4水平（圖3E、F）。這些結(jié)果表明KLF6是miR-21-5p的靶基因。

為進一步驗證KLF6在miR-21-5p抑制缺氧誘導的HPAEC損傷中的功能，本實驗用pcDNA-KLF6和miR-21-5p-mimic共轉(zhuǎn)染HPAEC，并評估細胞損傷的相關(guān)指標。結(jié)果顯示，在缺氧條件下，與pcDNA-Con和miR-21-5p-mimic共轉(zhuǎn)染比較，pcDNA-KLF6和miR-21-5p-mimic共轉(zhuǎn)染顯著增加HPAEC的LDH釋放水平（圖3G）和凋亡率（圖3H、I）。這些結(jié)果表明，過表達KLF6能消除miR-21-5p對缺氧誘導的HPAEC損傷的抑制作用。

圖3 miR-21-5p通過下調(diào)KLF6抗HPAEC缺氧損傷。A，缺氧對HPAEC中KLF6水平影響的代表性Western blot檢測；B，缺氧對HPAEC中KLF6水平影響的統(tǒng)計學分析；與Normoxia組比較：***P＜0.001，n=3。C和D，miR-21-5p和KLF6之間的堿基互補序列（C）以及通過熒光素酶活性測定法驗證（D）；與miR-NC組比較：###P＜0.001，n=3。E，miR-21-5p-mimic對HPAEC中KLF6水平影響的代表性Western blot檢測；F，miR-21-5p-mimic對HPAEC中KLF6水平影響的統(tǒng)計學分析；與miR-NC組比較：###P＜0.001，n=3。G，缺氧、miR-21-5p-mimic和KLF6對HPAEC釋放LDH影響的統(tǒng)計學分析；與Hypoxia+miR-NC+pcDNA-Con組比較：&&&P＜0.001，n=3。與Hypoxia+miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con組比較：$$$P＜0.001，n=3。H，缺氧、miR-21-5p-mimic和KLF6對HPAEC凋亡的代表性流式細胞術(shù)檢測結(jié)果I，缺氧、miR-21-5p-mimic和KLF6對HPAEC凋亡率的統(tǒng)計學分析；與Hypoxia+miR-NC+pcDNA-Con組比較：&&&P＜0.001；與Hypoxia+miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con組比較：$$$P＜0.001；n=3Fig. 3 miR-21-5p inhibits hypoxia-induced injury of HPAEC by down-regulating KLF6. A， representative Western blot detection of the effect of hypoxia on KLF6 level in HPAEC; B， statistical analysis of the effect of hypoxia on KLF6 level in HPAEC; compared with normoxia group: ***P＜0.001， n=3. C and D， base complementation sequence between miR-21-5p and KLF6 (C) was verified by luciferase activity assay (D); compared with miR-NC group， ###P＜0.001， n=3. E， representative Western blot detection of the effect of miR-21-5p-mimic on KLF6 level in HPAEC; F， statistical analysis of the effect of miR-21-5p-mimic on KLF6 level in HPAEC; compared with miR-NC group， ###P＜0.001， n=3. G， statistical analysis of effect of hypoxia， miR-21-5p-mimic and KLF6 on LDH release from HPAEC; compared with Hypoxia + miR-NC + pcDNA-Con group， &&&P＜0.001， n=3. H， representative flow cytometry results of hypoxia， miR-21-5p-mimic and KLF6 on apoptosis of HPAEC; I， statistical analysis of effect of hypoxia， miR-21-5p-mimic and KLF6 on apoptosis rate of HPAEC; compared with Hypoxia + miR-NC + pcDNA-Con group， &&&P＜0.001; compared with Hypoxia+miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con group， $$$P＜0.001; n=3

討 論

PAH是一種慢性進行性和致命性疾病[1]。而目前，常用的治療策略對PAH治療效果有限[11]。眾所周知，缺氧誘導的PAEC損傷參與低氧性PAH的病理過程[4，5]。以往的研究已經(jīng)報道，在缺氧誘導的大鼠PAH模型中，肺動脈血管內(nèi)膜完整性遭到嚴重破壞[8]。血管內(nèi)膜主要由血管內(nèi)皮構(gòu)成，血管內(nèi)皮不僅是血管與血液間的通透性屏障，而且血管內(nèi)皮能分泌多種血管活性物質(zhì)[12]。長期低氧能誘導血管內(nèi)皮功能障礙，進而誘導PAEC活化、血管炎癥增加、損傷凋亡、脫落和NO釋放降低、血管收縮舒張功能障礙最終導致血管重構(gòu)和血管閉塞，最終導致PAH的形成[13，14]。因此，抑制低氧誘導的PAEC損傷凋亡能促進肺動脈血管內(nèi)皮的修復和改善內(nèi)皮功能，進而改善PAH的血管重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，在缺氧誘導的HPAEC損傷的同時伴隨著miR-21-5p表達的降低，而過表達miR-21-5p則能顯著減輕缺氧誘導的HPAEC損傷，這一結(jié)果說明miR-21-5p可能是預防和治療PAH的新靶點。

本研究進一步對miR-21-5p發(fā)揮細胞保護的機制進行了探索。miRNA是通過轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因表達來發(fā)揮生物學效應(yīng)[6]。本研究首先通過生物信息學發(fā)現(xiàn)KLF6與miR-21-5p存在堿基互補序列，并通過熒光素酶活性法和Western blot證實KLF6是miR-21-5p的靶基因。Krüppel樣因子（KLF）可以與特定的DNA基序結(jié)合并調(diào)節(jié)代謝、細胞增殖和分化等各種細胞功能[15，16]。KLF6是該家族的一員，已經(jīng)被報道其能促進細胞凋亡的作用[16，17]。本研究結(jié)果顯示，miR-21-5p能通過下調(diào)KLF6來抑制缺氧誘導的HPAEC損傷。

總之，本研究結(jié)果顯示，缺氧能下調(diào)HPAEC中的miR-21-5p表達，而過表達miR-21-5p則能抑制缺氧誘導的HPAEC損傷，且miR-21-5p這一功能通過下調(diào)靶基因KLF6編碼的蛋白表達來實現(xiàn)。因此，miR-21-5p可能是預防和治療PAH的新靶點。