TRPV4基因的兩個(gè)不同變異導(dǎo)致變形性骨發(fā)育不良表型嚴(yán)重程度差異

袁佳雨，孫東蘭，李亞洲

（1河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050000；2石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院，石家莊 050000）

骨骼發(fā)育不良（skeletal dysplasia， SD）是一大類具有很強(qiáng)遺傳異質(zhì)性的嚴(yán)重出生缺陷，其臨床特征是骨和軟骨的生長、發(fā)育、分化及維持的異常[1]。SD的總體發(fā)生率約為1/5000，占新生兒出生缺陷的約5%，其表型嚴(yán)重程度各異，范圍可從輕度身材矮小到圍產(chǎn)期致死[2]。根據(jù)最新的分類方式，SD可分為42大類，461個(gè)病種，目前已知涉及的基因超過437個(gè)[3]。然而，對于某種特定SD，可能由于其罕見、異質(zhì)性強(qiáng)、致病機(jī)制復(fù)雜，而造成診療十分困難。

變形性骨發(fā)育不良（metatropic dysplasia， MD，MIM #156530）是一種罕見的SD病種，最早由Maroteaux等人定義[4]。MD患者的主要臨床特征是四肢較短，長骨變形且較短，關(guān)節(jié)的受限和增大，通常有脊柱側(cè)凸[5]。影像學(xué)檢查特征包括胸部狹窄，肋骨短，髂骨膨出，扁平椎且椎體拉長，長骨干骺端增大[6]。根據(jù)個(gè)人觀察和對文獻(xiàn)的回顧，Beck等認(rèn)為MD至少包括三個(gè)遺傳學(xué)亞型：一種非致死性常染色體隱性遺傳型，一種非致死性顯性遺傳型，和一種出生前或產(chǎn)后不久即死亡、可能的常染色體隱性遺傳型[7]。然而，目前的共識(shí)是，MD是一種由TRPV4基因的雜合子致病性變異所引起的常染色體顯性疾病[5，8]。TRPV4基因（MIM *605427）編碼瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族V成員4（transient receptor potential cation channel subfamily V member 4，TRPV4），是一種鈣滲透非選擇性陽離子通道[9]。TRPV4通過介導(dǎo)鈣內(nèi)流在軟骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞終末分化中起著重要的作用[10，11]。

本研究中，我們報(bào)道2例骨骼發(fā)育不良的病例，有著較大的表型嚴(yán)重程度差異。通過遺傳學(xué)檢測，在先證者樣本中分別檢出2個(gè)不同的TRPV4基因致病性變異。本研究的結(jié)果為該患病家庭的遺傳咨詢和再生育指導(dǎo)提供了重要根據(jù)，同時(shí)也為理解TRPV4的功能提供了一定理論支撐。

對象和方法

1 對象

本研究納入了2例骨骼發(fā)育不良的患者及其父母。病例1（Case 1）先證者是一位4歲女孩，因跌倒后右踝關(guān)節(jié)腫脹不消來院治療。其父母均體健，非近親關(guān)系，患兒是該夫婦第一個(gè)孩子（家系圖見圖1A）。影像學(xué)檢查結(jié)果顯示，該患兒右側(cè)脛腓骨遠(yuǎn)端骨折，髖骨損傷和多發(fā)性骨病變（圖1B、C）。病例2（Case 2）是一例引產(chǎn)胎兒，其父母體健，非近親關(guān)系，無遺傳病及出生缺陷家族史（家系圖見圖1D）。孕22周排畸超聲檢測結(jié)果顯示，胎兒股骨、脛腓骨和肱骨明顯短小而彎曲，脊柱側(cè)凸，椎體排列紊亂（圖1E、F）。由于臨床預(yù)后評(píng)估不良，該對夫婦自愿選擇引產(chǎn)。27周引產(chǎn)后的胎兒影像學(xué)表現(xiàn)和超聲吻合（圖1G、H）。

2 樣本采集

本研究收集臨床2例不同表型嚴(yán)重程度的骨骼發(fā)育不良個(gè)體及其父母，抽取病例1及其父母、Case 2父母各2管外周血，每管5 mL，分別為肝素鈉抗凝及EDTA-納抗凝；依常規(guī)抽取Case 2胎兒孕期臍血樣本3 mL，分裝各1.5 mL分別用上述兩種抗凝劑抗凝。

3 染色體核型分析

對2個(gè)先證者外周血樣本依照常規(guī)方法進(jìn)行傳統(tǒng)的G顯帶核型分析[12]。核型結(jié)果依據(jù)國際人類細(xì)胞遺傳命名體系（ISCN 2016版）進(jìn)行分析。

4 基因組DNA提取

使用EDTA-納抗凝血樣本，依常規(guī)方法提取基因組DNA，采用北京天根公司的TIANamp試劑盒。測得各樣本濃度均大于50 ng/μL，OD值260/280在1.8-2.0范圍內(nèi)，滿足后續(xù)試驗(yàn)需求，-20℃凍存。

5 染色體微陣列分析（Chromosome Microarray Analysis，CMA）

采用美國昂飛公司的CytoScan 750K染色體微陣列體系，采用廠家推薦方法對先證者的組DNA樣本進(jìn)行消化、擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記、雜交、洗滌、染色和掃描。使用體系配套ChAS軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對于基因組拷貝數(shù)變異設(shè)定疑似陽性閾值為：缺失或重復(fù)≥400 kb，雜合性缺失（loss of heterozygosity ，LOH）大于等于10 kb。

6 全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES）

首先對DNA雙端進(jìn)行修復(fù)，在3’端加1個(gè)A堿基。然后，將其連接測序adaptor，使用XP beads收集320 bp左右的片段。經(jīng)PCR擴(kuò)增，依據(jù)廠家提供方法，用IDT’s xGen Exome Research Panel （Integrated DNA Technologies，美國）將DNA片段雜交捕獲，洗脫并收集雜交產(chǎn)物。然后DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增并純化。接著，用qPCR法檢測文庫富集情況，用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies，美國）鑒定文庫片段分布和濃度。最后，使用Novaseq6000（Illumina，美國）檢測150 bp的pair-end讀長，從而對組DNA完成測序。原始數(shù)據(jù)使用CASAVA v1.82軟件進(jìn)行分析。測序數(shù)據(jù)用Burrows-Wheeler Aligner軟件以人類基因組參考序列（版本號(hào)hg19/GRCh37）進(jìn)行比對，以Picard v1.57（http://picard.sourceforge.net/）對PCR重復(fù)加以移除。使用Verita Trekker? Variants Detection System（貝瑞基因，北京）和GATK（https://software.broadinstitute.org/gatk/）軟件進(jìn)行變異篩選。使用ANNOVAR[13]和Enliven? Variants Annotation Interpretation System（貝瑞基因，北京）對變異進(jìn)行注釋和解讀。

7 生物信息學(xué)分析

依照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）和Swiss-Pdb Viewer（https://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html）對野生型和突變型蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建和分析。

結(jié) 果

1 臨床分析

依據(jù)臨床和影像學(xué)指征，2個(gè)被納入的病例分別是輕度和重度的骨骼發(fā)育不良。病例1為輕型，其表現(xiàn)有輕度的脊柱側(cè)彎，胸廓狹窄和干骺端加寬（圖1 B、C）。病例2為重型，引產(chǎn)后的X光檢測顯示四肢長骨短，呈啞鈴狀，伴脊柱畸形（圖1 G、H）。

圖1 家系圖和患兒的臨床表征圖。A，病例1的家系圖（先證者用黑色箭頭標(biāo)示）。B和C，病例1中患兒的X光影像，顯示有輕度的脊柱側(cè)彎，胸廓狹窄和干骺端加寬。D，病例2的家系圖（先證者用黑色箭頭標(biāo)示）。E—H， 病例2患兒孕期超聲（E、F）及引產(chǎn)后X光（G、H）影像，顯示有嚴(yán)重的脊柱側(cè)凸，長骨呈啞鈴形，干骺端不規(guī)則，四肢及軀干短小。Fig. 1 Pedigrees and clinical imaging data of the two metatropic dysplasia cases. A， pedigree of Case 1 in which the proband is indicated with dark arrow. B and C， X-ray images in Case 1 showed mild scoliosis， small chest， and mild metaphyseal widening. D， pedigree of Case 2 in which the proband is indicated with dark arrow. E to H， ultrasound images during pregnancy (E， F) and X-ray images post induced labor (G， H) of case 2 exhibited severe scoliosis， dumbbell-shaped long bones with metaphyseal irregularity， short extremities， and a short trunk

2 遺傳學(xué)分析

個(gè)先證者的染色體核型及CMA結(jié)果都未見異常（圖2）。全外顯子組測序檢出TRPV4基因的兩個(gè)雜合突變，以NM_021625轉(zhuǎn)錄本為準(zhǔn)，分別是：病例1患兒的TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)錯(cuò)義變異，和病例2患兒的TRPV4: c.1412_1414del(p.F471del)整碼缺失變異。其中，前者造成TRPV4編碼肽鏈797位的谷氨酸被賴氨酸替換，后者造成肽鏈471位的苯丙氨酸缺失（圖3）。經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，2個(gè)先證者的父母均為野生型，因此兩個(gè)變異均為新發(fā)（de novo）變異。

圖2 G顯帶核型分析。病例1為46， XX核型，病例2為46，XY核型Fig. 2 G banding karyotype analysis. G banding karyotype of Case 1 was 46， XX; and G banding karyotype of Case 2 was 46， XY

圖3 2個(gè)病例中檢出變異的Sanger測序結(jié)果，以及該變異在TRPV4蛋白分子特定結(jié)構(gòu)域中的位置。病例1 c.2389G＞A錯(cuò)義突變造成TRPV4編碼肽鏈797位的谷氨酸被賴氨酸替換；病例2 c.1412_1414del整碼缺失變異造成肽鏈471位的苯丙氨酸缺失Fig. 3. Sanger sequencing results， and the locations of the implied sequence changes in specific domains of the TRPV4 protein molecule in two cases. The c.2389G＞A mutation in Case 1 caused lysine to replace glutamate at peptide 797 of TRPV4; the c.1412_1414del mutation in Case 2 caused phenylalanine deletion at peptide 471

3 生物信息學(xué)分析

經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選，選擇PDB：6dvy.1.A（Seq Identity: 47.67%/ GMQE: 0.37）作為TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)錯(cuò)義變異相對應(yīng)的野生型模板，構(gòu)建野生、突變型的蛋白結(jié)構(gòu)模型。三維結(jié)構(gòu)分析顯示，p.E797K變異使相應(yīng)氨基酸的氫鍵距離變小，從而可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到影響（圖4）。

圖4 對TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)錯(cuò)義變異的生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)分析。A，TRPV4蛋白在該特定區(qū)段內(nèi)的野生型結(jié)構(gòu)模型。B，A中紅色框線內(nèi)的細(xì)節(jié)，含有E797氨基酸。C，E797K變異導(dǎo)致氫鍵距離自3.27pm（L）變至2.64pm（S）Fig. 4 Biophysical analysis of the TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K) variation. A， part of the three-dimensional structure of the wild type TRPV4. B， the detailed red block in A showing E797. C， the E797K mutation caused the hydrogen bond distance to change from 3.27pm (L) to 2.64pm (S)

討 論

人類TRPV4蛋白肽鏈含有871個(gè)氨基酸殘基，包含1個(gè)脯氨酸富集區(qū)段，6個(gè)錨蛋白（ankyrin，ANK）重復(fù)區(qū)，6個(gè)跨膜（transmembrane ，TM）功能域，以及1個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)（圖2）[14]。Everaerts等指明，在TM5和TM6之間存在一個(gè)假定的陽離子滲透孔[14]。近年來，TRPV4基因的致病性變異先后被證明可以導(dǎo)致一系列骨骼發(fā)育異常性疾病，包括常染色體顯性brachyolmia病（BO，MIM #113500）、脊椎干骺端結(jié)構(gòu)不良Kozlowski亞型（spondylometaphyseal dysplasia Kozlowski type，SMDK，MIM #184252）以及MD[15，16]。最初，MD的遺傳方式被認(rèn)為比較復(fù)雜，兼有常染色體顯性和隱性兩種模式[7]。Beck等認(rèn)為該病可以符合常染色體隱性模式，是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)一對健康夫婦重復(fù)多次分娩該病的患兒[7]。Kannu等發(fā)現(xiàn)在報(bào)道的病例中，受累與未受累的比值（1:20）并不支持常染色體隱性模式[17]。他們認(rèn)為子代重復(fù)患病的可能原因是親本的生殖腺嵌合。隨后，大量報(bào)道都支持MD符合常染色體顯性遺傳模式[5，8]。本研究中，我們在TRPV4基因檢測出2個(gè)新發(fā)雜合變異，c.2389G＞A(p.E797K)和c.1412_1414del(p.F471del)，符合該模式。本研究生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)分析有力的支持了c.2389G＞A變異的致病性，并且在亞分子水平為其導(dǎo)致的可能的蛋白結(jié)構(gòu)改變提供了一定的線索。但具體的影響，還倚賴結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探究。

MD患者表型的嚴(yán)重程度可能會(huì)有比較大的差別[4]。從臨床角度可以將MD分為輕型、經(jīng)典型和致死型，但各亞型之間并不能完全明確區(qū)分開[7]。迄今為止的文獻(xiàn)報(bào)道中，TRPV4基因變異所在的特定功能域和疾病表型嚴(yán)重程度并沒有呈現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)[8，18]。此外，Dai等指出，TRPV4基因的15號(hào)外顯子是MD相關(guān)變異的一個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，在他的研究中占了60%（14/23）的比重[6]。本研究中的2個(gè)變異，都是可重復(fù)發(fā)生的變異。其中，TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)報(bào)道過3次[6，8，19]。TRPV4已知的致病性變異大部分屬于錯(cuò)義變異，符合“獲得功能”（gain-offunction，GOF）的機(jī)制[20]。TRPV4基因的GOF變異可以激活鈣通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高和軟骨細(xì)胞分化的異常[8，21]。本研究的另一個(gè)變異TRPV4: c.1412_1414del(p.F471del)是第一個(gè)被報(bào)道的非錯(cuò)義變異，它導(dǎo)致一個(gè)進(jìn)化保守的氨基酸缺失，并且造成了患兒的夭折，這與本研究的表型相符[6，8]。我們推測，TRPV4變異所致MD的表型嚴(yán)重程度應(yīng)當(dāng)與變異類型及其所在功能域具體位置有關(guān)，但是這種關(guān)聯(lián)還需要大樣本的數(shù)據(jù)歸納總結(jié)才能有效建立。

Sox9是一種轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）向軟骨細(xì)胞分化，對軟骨形成的早期階段至關(guān)重要[22]。Sox9還通過指導(dǎo)軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)分子的表達(dá)在軟骨內(nèi)骨化中起著關(guān)鍵作用，包括軟骨內(nèi)骨化[23，24]。最近的一項(xiàng)研究指出，TRPV4基因的GOF變異可導(dǎo)致牙髓干細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子水平失調(diào)以及Sox9的上調(diào)[21]。NFATc1負(fù)責(zé)破骨細(xì)胞特異性的基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[25]。而TRPV4基因的GOF變異通過增加Ca2+/NFATc1途徑的活性來破壞成骨細(xì)胞的分化，并誘導(dǎo)與MD相關(guān)的軟骨內(nèi)骨化紊亂[26]。因此，每個(gè)變異所導(dǎo)致的表型很可能取決于Sox9和NFATc1的活性程度。而這也可能部分解釋了TRPV4基因中的不同變異如何導(dǎo)致MD的不同表型嚴(yán)重程度。

綜上所述，本研究在兩個(gè)變形性骨發(fā)育不良病例中分別檢測到了2個(gè)新發(fā)雜合致病性變異TRPV4: c.2389G＞A(p.E797K)和TRPV4: c.1412_1414del(p.F471del)。結(jié)果表明受累家庭的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低。另外，研究表明WES可作為一項(xiàng)快速、準(zhǔn)確的分子遺傳學(xué)診斷方法，對圍產(chǎn)期及兒科骨骼異常予以診斷。