牡荊苷通過促進(jìn)黏著斑激酶活化抑制心肌缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

趙越，黃磊，蘇楓*，龔群林

（1同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200000；2沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110002）

急性心肌梗死是嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題之一[1]。冠狀動(dòng)脈閉塞可導(dǎo)致心肌梗死，盡早恢復(fù)血流灌流是挽救心肌梗死的優(yōu)良策略，但缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）可加重心肌損傷，有時(shí)甚至?xí)?duì)心臟造成永久性損傷[2]。因此研究改善心肌I/R損傷的干預(yù)措施具有重要意義。

牡荊苷（vitexin，Vitx）屬于一種天然黃酮類化合物，在我國(guó)廣泛存在于薔薇科、馬鞭草科和禾本科等幾十種中草藥中?，F(xiàn)代藥理研究現(xiàn)已證實(shí)其具有如抗炎、抗氧化和抗腫瘤等廣泛的藥理作用[3-4]。在心血管方面的研究顯示，Vitx具有緩解心肌I/R損傷和改善心功能的作用[5-6]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）通路是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)的交匯點(diǎn)，近來大量研究顯示，F(xiàn)AK活化能改善心肌I/R損傷[7-8]。Vitx是否可通過調(diào)控該通路發(fā)揮抗心肌I/R損傷尚鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞模型和心肌I/R損傷大鼠模型，探討Vitx是否可通過調(diào)控FAK活化對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，為Vitx應(yīng)用于心肌梗死的治療提供新證據(jù)。

材料與方法

1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

H9C2大鼠心肌細(xì)胞和Annexin V-FITC/ PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；7～8周齡雄性SD大鼠（SPF級(jí)，290～310 g）購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（豫）2017－0001]；牡荊苷（Vitx，純度＞98%）購(gòu)自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；FAK抑制劑Y15和CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；Cleaved Caspase 3、FAK和p-FAK小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)、Vitx濃度篩選與H/R模型構(gòu)建

將H9C2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，取生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用不同濃度梯度（0～800 μmol/L）的Vitx刺激H9C2細(xì)胞24 h，用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力，篩選無細(xì)胞毒性的劑量范圍的Vitx用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。37 ℃條件下采用94% N2、5% CO2和1% O2的混合氣培養(yǎng)H9C2細(xì)胞4 h，之后，再置于常氧中培養(yǎng)2 h，建立H/R心肌細(xì)胞損傷模型。

3 細(xì)胞分組

為檢測(cè)Vitx對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，將H9C2細(xì)胞分為對(duì)照組（常氧培養(yǎng)）、H/R組和不同劑量Vitx治療組；其中不同劑量Vitx治療組H9C2細(xì)胞先分別采用5 μmol/L、10 μmol/L和50 μmol/L Vitx預(yù)處理1 h，然后再構(gòu)建H/R模型。為驗(yàn)證Vitx通過調(diào)控FAK活性參與對(duì)H/R下的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，將H9C2細(xì)胞分為對(duì)照組（常氧培養(yǎng)）、H/R組、H/R+Y15組（1 μmol/L Y15預(yù)處理1 h，再構(gòu)建H/R模型）和H/R+Y15+ Vitx（50 μmol/L）組。

4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

將H9C2細(xì)胞種植到96孔板中，按照各組分組方法處理后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，并在37 ℃條件下孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的光密度值。細(xì)胞活力=處理組光密度值/對(duì)照組光密度值×100%。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用無EDTA的0.2%胰酶消化各組細(xì)胞，用以3600 r/min離心5 min收集細(xì)胞。用PBS重懸細(xì)胞2次，然后加入400 μL結(jié)合緩沖液并混勻，在暗室加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫孵育15 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

6 心肌I/R損傷模型的建立和分組處理

SD大鼠經(jīng)規(guī)范喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行心肌I/R損傷造模：將禁食12 h的大鼠通過腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100g）麻醉后，仰臥放置在操作臺(tái)上，進(jìn)行左開胸手術(shù)，用7-0絲線活結(jié)結(jié)扎左心耳下的冠狀動(dòng)脈左前降支，缺血1 h后，解開活結(jié)，實(shí)現(xiàn)血液再灌注。30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R組和不同劑量Vitx治療組。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)程序同I/R造模手術(shù)，但不進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎；不同劑量Vitx治療組大鼠在I/R造模1 h前，分別通過尾靜脈注射10 μmol/L、50 μmol/L和100 mg/kg Vitx。I/R術(shù)后1 d，麻醉大鼠，仰臥固定，開胸，從心尖處進(jìn)針至左心室并灌注生理鹽水，同時(shí)在右心耳開口，灌注至肝臟變白以及血水變?yōu)闊o色時(shí)切取心臟。

7 免疫組織化學(xué)染色

用0.9%鹽水沖洗心臟表面，用眼科剪將心房及主動(dòng)脈等相連組織剪去，然后剪去右心室，收集左心室組織。將左心室組織沿長(zhǎng)軸剪成倆部分，取一部分左心室組織沉浸在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后用Leica VT1200S全自動(dòng)振動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）連續(xù)切為2 mm厚的切片。收集切片，然后依次經(jīng)70%乙醇1 h、80%乙醇1 h、90%乙醇1 h、95%乙醇30 min、無水乙醇15 min、醇苯5 min和二甲苯15 min后行石蠟包埋。將石蠟包埋的左心室心肌組織用Leica 石蠟切片機(jī)切成5 μm厚的切片，然后依次經(jīng)60 ℃烤片45 min、二甲苯（15 min×2次）、無水乙醇（10 min×2次）、95%乙醇10 min、90%乙醇10 min、80%乙醇10 min、70%乙醇10 min和自來水浸泡10 min，加入3% H2O2浸泡10 min除去內(nèi)源性過氧化氫酶，然后用檸檬酸緩沖液煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)。用10%BSA封閉30 min后，用小鼠抗Cleaved-Caspase 3單克隆抗體（1:100）4 ℃孵育過夜；PBS洗片后，滴加生物素標(biāo)記的抗小鼠二抗（1:100），室溫孵育1 h；PBS洗片后，滴加SABC（1:100）室溫孵育45 min；PBS洗片后，DAB顯色5 min；清水沖洗后，蘇木素復(fù)染5 min；脫水、透明后，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察左心室心肌組織中Cleaved Caspase 3免疫反應(yīng)性。

8 TUNEL染色

將左心室心肌片脫蠟水化后，用不含DNase的蛋白酶K作用30 min，PBS洗片，加入3% H2O2浸泡10 min除去內(nèi)源性的過氧化氫酶；PBS洗片后，加入生物素標(biāo)記的TUNEL反應(yīng)液并室溫孵育1 h；PBS洗片后，加入終止液室溫孵育10 min；PBS再次洗片后，加入HRP標(biāo)記的鏈酶親和素并室溫孵育1 h；PBS洗片后，DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染5 min；脫水、透明后，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察左心室心肌組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

9 Western blot

用RIPA提取培養(yǎng)的細(xì)胞以及新鮮的左心室心肌組織中的蛋白，蛋白經(jīng)定量后，進(jìn)行Western blot電泳和電轉(zhuǎn)。用10%BSA封閉PVDF膜上蛋白30 min，然后用小鼠抗FAK（1:3000）、p-FAK（1:1000）和GAPDH抗體（1:10000）4 ℃孵育過夜；TBS-T洗膜后，滴加HRP標(biāo)記的抗小鼠二抗（1:2000），室溫孵育1 h；TBS-T洗膜后，在均勻涂灑SH Super-Sig?超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑（杭州申花科技有限公司）后用SH-Focus 523化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）電化學(xué)發(fā)光顯像。用Image J軟件量化蛋白的光密度值，GAPDH用作內(nèi)部參照（評(píng)估上樣總量差異），然后以計(jì)算p-FAK相對(duì)FAK的表達(dá)水平，p-FAK的相對(duì)表達(dá)水平=（p-FAK光密度值/GAPDH光密度值）/（FAK光密度值/GAPDH光密度值）。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用Graph-Pad Prism7.0軟件采用單因素方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SNK-q法對(duì)多組的均數(shù)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Vitx劑量依賴性抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷與FAK活性降低

首先，用CCK-8法篩選Vitx的劑量范圍，可見Vitx在1～100 μmol/L劑量范圍內(nèi)對(duì)H9C2細(xì)胞無細(xì)胞毒性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5～50 μmol/L劑量范圍（圖1A）。用CCK-8法觀察Vitx對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，H/R能導(dǎo)致H9C2細(xì)胞的細(xì)胞活力降低，而10 μmol/L和50 μmol/L Vitx治療能抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的細(xì)胞活力降低（圖1B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，H/R能導(dǎo)致H9C2細(xì)胞凋亡，而（5～50）μmol/L Vitx治療能抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡（圖1C和1D）。Western blot檢測(cè)（圖1E和1F）顯示，H/R能導(dǎo)致H9C2細(xì)胞中p-FAK的表達(dá)降低，而10 μmol/L和50 μmol/L Vitx治療能抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中p-FAK的表達(dá)降低。

2 Vitx緩解FAK抑制劑對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的加重作用

為明確Vitx是否通過促進(jìn)FAK活化來抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)一步觀察了Vitx對(duì)FAK抑制劑Y15預(yù)處理H9C2細(xì)胞的H/R模型的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示：Y15預(yù)處理顯著增加 H/R誘導(dǎo)的 H9C2細(xì)胞凋亡增加和細(xì)胞活力降低，Vitx處理則顯著抑制Y15預(yù)處理對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力降低的增強(qiáng)作用（圖2A-C）；Western blot檢測(cè)顯示：Y15預(yù)處理顯著增加 H/R誘導(dǎo)的 H9C2細(xì)胞p-FAK表達(dá)降低，Vitx處理可逆轉(zhuǎn)Y15預(yù)處理對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞p-FAK表達(dá)的降低（圖2D、F）。

圖2 Vitx抑制Y15對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷和p-FAK表達(dá)降低的增強(qiáng)作用。A和B，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Vitx和Y15對(duì)H/R模型細(xì)胞凋亡的影響；C，CCK-8法檢測(cè)Vitx和Y15對(duì)H/R模型細(xì)胞活力的影響；D和E：Western blot檢測(cè)Vitx和Y15對(duì)H/R模型細(xì)胞中p-FAK表達(dá)的影響；與對(duì)照組比較，***P＜0.001；與H/R組比較，#P＜0.05；與H/R+Y15組比較，&P＜0.05；n=3。Fig. 2 Vitx inhibited the aggravation effect of Y15 on H/R-induced injury and p-FAK expression decrease of H9C2 cell. A and B， flow cytometry detection for the effect of Vitx and Y15 on apoptosis in H/R model cell; C， CCK-8 assay for the effect of Vitx and Y15 on cell viability in H/R model cell; D and E， Western blot detection for the effect of Vitx and Y15 on p-FAK expression in H/R model; ***P＜0.001 vs. Control (Ctrl) group; #P＜0.05 vs. H/R alone group; &P＜0.05 vs. H/R + Y15 group; n=3.

3 Vitx抑制I/R誘導(dǎo)的大鼠心肌組織損傷和FAK活性下調(diào)

利用心肌I/R損傷模型進(jìn)一步分析Vitx對(duì)心肌組織損傷和FAK活性的影響表明：I/R顯著增加大鼠左心室心肌細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例和Cleaved Caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞比例，降低p-FAK表達(dá)；而50 mg/kg和100 mg/kg Vitx治療能顯著抑制I/R誘導(dǎo)的大鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡增加和p-FAK表達(dá)下調(diào)（圖3）。

圖 1 Vitx抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷和p-FAK表達(dá)降低。A，CCK-8法篩選Vitx的劑量范圍；B，CCK-8法檢測(cè)Vitx對(duì)H/R模型細(xì)胞活力的影響；C和D，Vitx對(duì)H/R模型細(xì)胞凋亡影響的代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；E和F，Vitx對(duì)H/R模型p-FAK表達(dá)影響的代表性Western blot檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與H/R組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；n=3Fig. 1 Vitx inhibited the H/R-induced myocardial cell injury and the decrease of p-FAK expression. A， the dose range of Vitx was screened by CCK-8 assay; B， CCK-8 assay for the effect of Vitx on cell viability in H/R model; C and D， representative flow cytometry detection and statistical analysis for the effect of Vitx on apoptosis of H/R model cell; E and F， representative Western blot detection and statistical analysis for effect of Vitx on p-FAK expression of H/R model cell; *P＜0.05， **P＜0.01，***P＜0.001 vs. Control (Ctrl) group; #P＜0.05， ##P＜0.01， ###P＜0.001 vs. H/R alone group; n=3

圖 3 Vitx能抑制I/R誘導(dǎo)的大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡和p-FAK表達(dá)降低。A，代表性TUNEL染色和Cleaved Caspase 3免疫組織化學(xué)染色圖（比例尺，20μm）；B，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C，Cleaved Caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D，p-FAK水平的代表性Western blot檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與假手術(shù)組比較，***P＜0.001；與I/R組比較，##P＜0.01，###P＜0.001；n=6。Fig. 3 Vitx inhibited I/R-induced myocardial cell injury and the decrease of p-FAK expression in the rats. A， representative TUNEL staining and Cleaved Caspase-3 immunohistochemical staining images (scale bar， 20 μm); B， statistical analysis of the proportion of TUNEL positive cells; C， statistical analysis of the proportion of Cleaved Caspase-3 positive cells; D， representative Western blotting and statistical analysis of p-FAK level; ***P＜0.001 vs. Sham group; ##P＜0.01， ###P＜0.001 vs. I/R alone group; n=6

討 論

目前已有如溶栓治療、血管支架和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等多種干預(yù)措施用于心肌梗死患者的治療[9]。而這些干預(yù)措施對(duì)心肌恢復(fù)灌流再次造成的心肌二次損傷并沒有作用效果。因此，需要對(duì)心肌I/R損傷的治療措施進(jìn)行進(jìn)一步研究。目前，中藥治療心肌I/R損傷是一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域，且眾多研究表明，中藥在治療心肌I/R損傷中發(fā)揮了重要的有益作用[10-11]。Vitx是從薔薇科、馬鞭草科和禾本科等中藥材中提取的一種具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤的天然黃酮類化合物[3-4]，且在我國(guó)原材料資源豐富，具有極高的研究?jī)r(jià)值。雖有研究[5-6]表明，Vitx能改善心肌I/R損傷，但為推進(jìn)其加快應(yīng)用于臨床，仍需對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步研究。

心肌細(xì)胞損傷是心肌I/R損傷病理過程的一個(gè)最重要參與者[12]，并且其還是導(dǎo)致心肌重塑、心率不齊、心力衰竭和心功能減退的重要原因[13]。因此，研究抑制心肌I/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的策略具有重要意義。本研究顯示，Vitx在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中均能抑制I/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，說明其在心肌梗死中具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，其活化后可促使黏著斑（focal adhesion，F(xiàn)A）上的靶蛋白磷酸化，進(jìn)而通過激活下游的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡和免疫等一系列過程生理過程[14]。之前研究指出，增強(qiáng)心臟FAK活性可通過激活下游效應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)來減輕I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[7-8，15]。本研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中，Vitx抑制I/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的過程中伴隨著促進(jìn)FAK的活化，這些結(jié)果提示，Vitx抑制I/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的作用可能與其增強(qiáng)FAK活化相關(guān)。為證明Vitx能通過增強(qiáng)FAK活化在心肌I/R中發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步采用FAK抑制劑Y15預(yù)處理H9C2細(xì)胞，再給予H/R處理，并觀察Vitx的作用，研究結(jié)果顯示，Vitx能逆轉(zhuǎn)Y15對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的加重作用，這一結(jié)果證明了Vitx確實(shí)能通過促進(jìn)FAK活化減輕I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，Vitx可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受心肌I/R損傷，且這一作用可以通過促進(jìn)FAK活化實(shí)現(xiàn)。本研究還為Vitx將來應(yīng)用于心肌梗死的治療提供了新的理論依據(jù)。