黏蛋白MUC1、MUC4和MUC6在胰腺癌中的表達及預后意義

鐘國棟 ，蘭婷，李國平張聲陳余朋陳林鶯

（1福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，福州 350000；2福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院病理科，福州 350000；3福建醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，福州 350000；4福建省癌癥和神經(jīng)退行性疾病轉(zhuǎn)化研究重點實驗室，福州 350000）

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma， PAAD）是常見的消化道惡性腫瘤之一，手術(shù)為主的綜合治療是其主要的治療手段[1]。除了廣泛應(yīng)用于臨床的傳統(tǒng)預后預測因子如組織學分型、分級和TNM分期[2]，新近的基因組學方法用以識別本質(zhì)分子特征等手段也被推薦用于改善PAAD患者的風險預測[3，4]。盡管對PAAD的診療有了很大的進展，但其癌癥相關(guān)疾病死亡率仍高居第四位，即使是仍處于疾病早期的患者。因此，尋找新的預后預測因子是PAAD防治的重要內(nèi)容，其中操作簡單而費用低廉的免疫組化方法仍是臨床推薦的常用手段。

黏蛋白（mucins， MUCs）是一組包含21個家族成員的高分子量糖蛋白，富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的核心肽主鏈和通過O-糖苷鍵連接的寡糖殘基結(jié)構(gòu)域。MUCs主要分為分泌型和膜結(jié)合型，正常情況下分布在消化道表面提供粘膜保護，介導細胞分化、粘附、信號轉(zhuǎn)導和免疫反應(yīng)，異常的MUCs與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5，6]。近年來，MUCs表達組合作為潛在生物標記引起人們的關(guān)注[7-9]，世界衛(wèi)生組織（WHO）綜合MUC1、MUC2、MUC5AC和MUC6表達用于胰腺導管內(nèi)乳頭狀病變的鑒別診斷，Sierzega等人發(fā)現(xiàn)根據(jù)MUC3、MUC5AC和MUC6的表達情況可以區(qū)分胰腺良惡性病變。但是，MUCs表達組合對PAAD預后意義研究甚少。

MUCs家 族 中，MUC1、MUC4和MUC6與PAAD及其前體病變的進展有關(guān)[10，11]。MUC1是一種跨膜蛋白，正常情況下表達于正常腺體和管腔上皮細胞的頂端，異常表達與包括PAAD在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[12，13]。全長MUC1形成異二聚體，其N端和C端介導不同的生理功能，在癌細胞中，C端在胞外蛋白酶的作用下從N端游離，當癌細胞失去極性，C端在整個細胞膜和胞質(zhì)內(nèi)重新分布，這種分布方式與非小細胞肺癌預后不良相關(guān)[14，15]，但與PAAD臨床病理特征及預后的關(guān)系不太明確?？缒さ鞍譓UC4是含有獨特表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域的黏蛋白，與PAAD預后不良有關(guān)[17，18]，MUC6是分泌型凝膠形成蛋白，與腫瘤細胞分化相關(guān)，可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19，20]，這3種黏蛋白的異常表達是否能進一步分層PAAD預后作用及其潛在的分子機制目前均不明確。

因此，本研究對公共TCGA數(shù)據(jù)庫中MUC1、MUC4和MUC6的mRNA表達以及PAAD臨床隊列中免疫組織化學方法檢測的蛋白表達進行分析，首先分別探討MUCs異常表達與PAAD臨床病理特征和預后的關(guān)系，接著進一步分析三者的組合表達對PAAD預后分層作用，最后根據(jù)轉(zhuǎn)錄水平篩選出顯著差異表達基因（DEGs），并通過基因本體（GO）分析對差異表達進行富集。

材料和方法

1 研究對象

PAAD臨床資料及mRNA數(shù)據(jù)下載自癌癥基因組圖譜（TCGA，https://cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，最后納入171例PAAD患者和4個正常組織標本。臨床樣本收集自2006年至2016年在福建醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院連續(xù)診斷并接受手術(shù)切除的168例患者，排除11例未能獲得適當IHC染色的病例。復習所有HE切片，組織學診斷和分級根據(jù)WHO標準，同時評估淋巴血管侵犯（LVI）和神經(jīng)侵犯（NI）。其他信息包括年齡、腫瘤大小、pN分期和pT分期摘自醫(yī)院病歷系統(tǒng)。OS定義為從最初診斷到死亡的時間間隔，兩組數(shù)據(jù)均排除術(shù)后1個月內(nèi)死亡的患者。本研究獲得福建醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院機構(gòu)研究倫理委員會批準。

2 組織芯片構(gòu)建及免疫組織化學染色

每個病例獲得兩個直徑2.5 mm的腫瘤組織和一個正常組織構(gòu)建組織芯片，連續(xù)4 μm切片，其中一張行HE染色以確認腫瘤存在[21]。免疫組織化學染色（IHC）根據(jù)產(chǎn)品說明書進行，抗MUC1/DF3（EP85）、MUC4（8G7）和MUC6（MRQ20）單克隆抗體均購自中國北京中山生物技術(shù)有限公司。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化和抗原修復（EDTA pH 8.0，37°C 30 min）后，用Dako EnVision FLEX+檢測系統(tǒng)（Dako，丹麥）和DAB檢測試劑盒（Ventana，美國）進行染色。所有切片均經(jīng)蘇木素復染。

3 免疫組織化學染色結(jié)果評價

MUC1的表達分為極性（MUC1P）和非極性表達（MUC1D）[14，15]，MUC1P表達指局限于管腔上皮細胞頂端水平的染色且MUC1D陽性細胞＜10%或陰性著色；MUC1D表達指陽性細胞＞10% ，染色分布在整個細胞表面或細胞質(zhì)內(nèi)。以陽性腫瘤細胞的百分比乘以染色強度來確定MUC4和MUC6的染色評分，陽性細胞百分率記為0%～100%，而染色強度分級為0到3，計算染色評分的平均數(shù)作為閾值來定義MUC4和MUC6的高表達或低表達。

4 差異表達基因鑒定與基因本體分析

利用TCGA數(shù)據(jù)庫進行基因本體富集（GO）分析，根據(jù)MUC1、MUC4和MUC6表達水平的中位數(shù)，將PAAD患者分為高表達組和低表達組，用R語言的Limma軟件包分析各組間的差異表達基因（DEGs），LogFC＞1且adjustP＜0.05的DEGs是顯著上調(diào)基因，而LogFC＜-1且adjustP＜0.05的DEGs是顯著下調(diào)基因，Venn軟件在線聚類，并將差異基因集作為一個整體進行GO分析。

5 統(tǒng)計分析

使用SPSS.V.18統(tǒng)計軟件包進行，F(xiàn)isher精確檢驗分析MUC1、MUC4和MUC6表達與年齡、性別、腫瘤部位、組織學分級、pN分期、pT分期、LVI和NI的相關(guān)性，Kaplan-Meier和多變量Cox回歸分析評估生存數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有顯著性。

結(jié) 果

1 病例資料

TCGA數(shù)據(jù)171例PDDA患者中，93例男性和78例女性，平均年齡為64.54±10.86歲（35-88歲），TNMⅠ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期161例，Ⅲ～Ⅳ期7例，3例狀態(tài)不明，平均隨訪時間47.14±39.01個月（2.58～228.01個月）。臨床隊列中，96名男性和61名女性，平均年齡為59.6±11.03歲（范圍為28-86歲），TNMⅠ～Ⅱ期133例，Ⅲ～Ⅳ期24例，隨訪135例，其中114例死于PDDA，平均隨訪時間18.83±14.60個月（2～71個月）（表1）。

2 MUC1、MUC4和MUC6在胰腺癌中的表達

在正常組織中，MUC1陽性染色局限于管腔上皮細胞頂端水平（圖1A），MUC4呈陰性表達，MUC6呈局灶性胞質(zhì)陽性染色（圖1）。對于PAAD癌組織，MUC1陽性著色分布于管腔側(cè)、胞質(zhì)內(nèi)或整個細胞表面（圖1B、C），MUC4（圖1E、F）和MUC6（圖1H、I）呈局灶性或彌漫性胞質(zhì)染色。

圖1 胰腺癌和癌旁組織中MUC1、MUC4和MUC6表達的免疫組織化學檢測。A，癌旁組織中MUC1免疫陽性染色局限于管腔上皮細胞頂端水平；B，分化好的胰腺癌MUC1免疫陽性著色；C，差分化胰腺癌MUC1免疫陽性著色；D.在癌旁組織MUC4呈陰性表達；E，胰腺癌MUC4呈局灶性胞質(zhì)染色；F，胰腺癌MUC4呈彌漫性胞質(zhì)染色；G，癌旁組織MUC6呈局灶性胞質(zhì)染色；H，差分化胰腺癌MUC6呈局灶性胞質(zhì)染色；I，分化好的胰腺癌MUC6 呈彌漫性胞質(zhì)染色。比例尺，20 μmFig. 1 Immunohistochemical examination of expressions of MUC1， MUC4 and MUC6 in the pancreatic adenocarcinoma and the paired paracancerous tissue. A， polarized staining of MUC1 in pancreatic adenocarcinoma; B， polarized staining of MUC1 in well differentiated tissues of pancreatic adenocarcinoma; C， depolarized staining of MUC1 in poorly differentiated tissues of pancreatic adenocarcinoma; D， negative staining of MUC4 in the paired paracancerous tissue; E， focal positive cytoplasmic staining of MUC4 in pancreatic adenocarcinoma; F， diffuse cytoplasmic staining of MUC4 in pancreatic adenocarcinoma; G， focal cytoplasmic positive staining of MUC6 in the paired paracancerous tissue; H， focal cytoplasmic staining of MUC6 in poorly differentiated tissues in pancreatic adenocarcinoma; I， diffuse cytoplasmic staining of MUC6 in well differentiated tissues of pancreatic adenocarcinoma. Scare bar， 20 μm

在TCGA數(shù)據(jù)中，癌組織MUC1和MUC4 mRNA水平比正常組織顯著升高（分別P=0.0082和0.043，圖2A，C），MUC6表達也升高但差異無顯著性（P=0.088，圖2E）。臨床隊列癌組織中，87（55.4%）例MUC1呈非極性表達（圖2B），83（52.9%）例MUC4C呈陽性表達（圖2D），121（77.1%）例MUC6呈陽性表達（圖2F），均顯著高于相鄰正常組織（P＜0.0001），正常組織中1例MUC1呈非極性表達，0例MUC4和26例MUC6呈陽性表達。

圖2 胰腺癌組織和正常組織中MUC1、MUC4和MUC6的表達比較。A，基于TCGA數(shù)據(jù)的 MUC1、MUC2和MUC4 mRNA表達比較；B，基于臨床隊列的MUC1、MUC2和MUC4蛋白表達比較Fig. 2 Comparison of MUC1， MUC4 and MUC6 expression between normal and tumor tissues. A， TCGA data-based comparison of mRNA expression of MUC1， MUC2 and MUC4; B， clinical cohort-based comparison of protein expression of MUC1， MUC2 and MUC4.

3 胰腺癌組織中MUC1，MUC4和MUC6蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

Fisher精確檢驗分析顯示：在PAAD中，87例呈MUC1非極性表達，MUC1異常表達與組織學分級和淋巴結(jié)受累顯著正相關(guān)，52例呈MUC4高表達，MUC4的表達與臨床病理特征無關(guān)，103例呈MUC6高表達，MUC6高表達與組織學分級和LVI顯著負相關(guān)（表1）。

表1 MUC1、MUC4和MUC6表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 Relationship between MUCs expression and patients’ clinicopathological demographics

4 胰腺癌組織中MUC1、MUC4和MUC6的表達與預后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)中，以mRNA水平的中位數(shù)作為閾值，MUC4高表達與患者預后呈負相關(guān)，MUC1及MUC6 mRNA水平與預后無明顯相關(guān)性（圖3A)。對于臨床隊列，Kaplan-Meier分析顯示，MUC1極性表達和MUC4低表達的患者的OS顯著延長，而MUC6的表達與患者的生存率無關(guān)（圖3B）。

圖3 MUC1、MUC4和MUC6的表達與胰腺癌患者總生存率關(guān)系的Kaplan-Meier分析。A，基于TCGA數(shù)據(jù)的MUC1、MUC4和MUC6 mRNA表達水平與胰腺癌患者總生存率關(guān)系分析；B，基于臨床隊列的MUC1、MUC4和MUC6蛋白表達水平與胰腺癌患者總生存率關(guān)系分析Fig. 3 Kaplan-Meier analysis for relationship of expression of MUC1， MUC2 and MUC4 with overall survival rate of patients with pancreatic adenocarcinoma. A， TCGA data-based analysis for relationship of mRNA levels of MUC1， MUC2 and MUC4 with overall survival rate of patients with pancreatic adenocarcinoma; B， clinical cohort-based analysis for relationship of protein expression levels of MUC1， MUC2 and MUC4 with overall survival rate of patients with pancreatic adenocarcinoma

將臨床隊列中患者的年齡、性別、腫瘤部位、pT分期、組織學分級、pN分期、NI、LVI、MUC1、MUC4和MUC6表達在內(nèi)的多變量進行Cox回歸分析顯示：MUC4狀態(tài)是PAAD患者預后獨立不利因素（HR=1.705；95% CI，1.144～2.541；P=0.009）（表2）。

表2 胰腺癌患者總生率的單因素和多因素分析Tab. 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival of patients with pancreatic adenocarcinoma

Kaplan-Meier生存分析顯示，在mRNA水平上，僅MUC1與MUC4而非MUC6組合有預后分層趨勢（圖4A），然而，結(jié)合MUC1蛋白的表達模式，MUC1/MUC4和MUC1/MUC6組合均顯示預后趨勢（圖4B）。進一步分層分析顯示，MUC1（極性）MUC4（低）表達患者的OS明顯長于MUC1（非極性）MUC4（低）表達者（Logrank=5.388，P=0.020）和MUC1（非極性）MUC4（高）表達者（Logrank=14.612，P＜0.0001），在MUC1表達相同的情況下，MUC6高表達的患者比MUC6低表達的患者有更好的OS（Logrank=5.138，P=0.023）。值得注意的是，無論是mRNA還是蛋白表達水平，MUC1、MUC4和MUC6組合都對PAAD預后具有分層意義（P值分別是0.023和0.001，圖4）。

圖4 MUC1、MUC4和MUC6組合表達與胰腺癌患者總生存率關(guān)系的Kaplan-Meier分析。A、C、E：mRNA水平；B、D、F：蛋白水平。A，及與TCGA數(shù)據(jù)的MUC1、MUC4和MUC6 mRNA組合表達與與胰腺癌患者總生存率關(guān)系分析；B，基于臨床隊列的MUC1、MUC4和MUC6 mRNA組合表達與與胰腺癌患者總生存率關(guān)系分析；MUC1-，MUC1低表達或極性表達；MUC1+，MUC1高表達或非極性表達；MUC4-，MUC4低；MUC4+，MUC4高；MUC6-，MUC6低表達；MUC6+，MUC6高表達Fig. 4 Kaplan-Meier analysis of the relationship between the combined expression of MUC1， MUC4 and MUC6 and the overall survival rate of patients with pancreatic adenocarcinoma. A， TCGA data-based analysis of the relationship between the combined mRNA expression of MUC1， MUC4 and MUC6 and the overall survival rate of patients with pancreatic adenocarcinoma; B， clinical cohort-based analysis of the relationship between the combined protein expression of MUC1， MUC4 and MUC6 and the overall survival rate of patients with pancreatic adenocarcinoma; MUC1-， MUC1 low or polarized expression; MUC1+， MUC1 high or depolarized expression; MUC4-， MUC4 low; MUC4+， MUC4 high; MUC6-， MUC6 low; MUC6+， MUC6 high

5 胰腺癌中MUC1、MUC4和MUC6顯著差異表達基因及基因本體富集分析

與MUC1、MUC4和MUC6顯著相關(guān)的差異表達基因（DEG）分別有3199、644和422個（圖5A），其中分別有1123、238和397個基因表達上調(diào)和2076、406和25個基因表達下調(diào)，與MUC1和MUC4同時相關(guān)的基因有27個，但無基因與MUC1、MUC4和MUC6同時相關(guān)（圖5B，C）。

圖5 TCGA數(shù)據(jù)庫中與MUC1、MUC4和MUC6相關(guān)的差異表達基因及其Venn diagrams分析。A，DEGs火山圖，紅色點表示上調(diào)，綠色點表示下調(diào)；B，上調(diào)DEGs的交集；C，下調(diào)DEGs的交集Fig. 5 Differentially expressed genes associated with MUC1， MUC4 and MUC6 identified from TCGA database and analysis by Venn diagrams. A， volcano plots representing DEGs， data points in red represent up-regulated genes， and green represent down-regulated genes; B， intersection of up-regulated DEGs; C， intersection of down-regulated DEGs

GO富集分析表明，DEGs的生物學功能主要富集在膜電位調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答等方面，對于細胞成分，DEGs主要與T細胞受體復合物、離子通道和轉(zhuǎn)運體復合物以及質(zhì)膜信號受體復合物等相關(guān)，而分子功能主要體現(xiàn)在離子通道活性及抗原結(jié)合等方面（P＜4×10-12，圖6）。

圖6 MUC1、MUC4和MUC6相關(guān)的差異表達基因本體富集分析Fig. 6 Gene ontology enriched analysis for differentially expressed genes of MUC1， MUC4 and MUC6

討 論

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)和臨床樣本分析MUC1、MUC4和MUC6在PAAD中的表達及其預后意義，研究發(fā)現(xiàn)這3種黏蛋白的聯(lián)合表達對PAAD有預后分層作用，從mRNA和蛋白表達水平探討了MUC1、MUC4和MUC6聯(lián)合表達對PAAD患者的預后意義，并通過差異基因富集分析發(fā)現(xiàn)，與該三種黏蛋白相關(guān)的DEGs的生物學功能主要富集在膜電位調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和質(zhì)膜信號受體等方面，在PAAD的發(fā)展過程中可能發(fā)揮疊加效應(yīng)或功能互補作用。

本研究從mRNA和蛋白表達水平進一步證實MUC1、MUC4和MUC6在PAAD癌組織中存在異常表達。已有的研究對MUC1的免疫組化評分采取染色強度、陽性細胞百分比或兩者相結(jié)合的方式進行評分，導致不同研究之間的閾值存在顯著不同[8，16，22]，而本研究采取極性或非極性表達模式的替代評分方法，發(fā)現(xiàn)55.4%的PAAD患者的細胞漿和細胞膜出現(xiàn)異常MUC1染色，并且這種著色與更高的組織學級別、更多淋巴結(jié)受累和預后差密切相關(guān)，與已有的研究結(jié)果一致[13]。盡管在正常胰腺組織中可檢測到MUC4 mRNA，但MUC4蛋白在正常組織中不表達，在癌組織中表達顯著升高。我們發(fā)現(xiàn)，MUC4在PAAD中的表達率為52.9%，介于32%與82%之間[17，18]，是PAAD獨立的預后因子，但與PAAD臨床病理學特征無顯著相關(guān)性。MUC6是胃幽門腺黏蛋白，據(jù)報道在胰腺上皮內(nèi)腫瘤中表達上調(diào)而在PAAD中表達下調(diào)[11，23，24]。與之相反，我們的研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，癌組織中MUC6在RNA轉(zhuǎn)錄水平表達上調(diào)，在蛋白水平顯著過表達，這與Pillai等研究結(jié)果相似[25]，MUC6高表達在分化良好的腫瘤細胞和更少的淋巴血管浸潤中更常見。

盡管單個的MUCs表達被認為是PAAD的預后因素，但其臨床應(yīng)用仍然受到限制，部分原因可能是由于不同研究結(jié)果之間的差異[26，27]。最近，有研究建議使用2個或3個MUCs組合來分層癌癥患者的預后，應(yīng)用MUC4、MUC16和MUC20組合和MUC14和MUC15組合分別可以進一步分層人類多種惡性腫瘤和胃癌的作用[28，29]。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用MUC1、MUC4或MUC6特別是蛋白表達組合可以分層PAAD患者預后作用，特別是聯(lián)合MUC1、MUC4和MUC6三者的表達組合對PAAD預后有顯著的分層意義，這三種黏蛋白組合有望成為PAAD患者重要的預后指標，從而優(yōu)化臨床對患者的術(shù)后管理。

MUC1和MUC4均屬于膜結(jié)合蛋白，通過抑制細胞與細胞或抑制細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用從而促進胰腺癌細胞的侵襲潛能[30，31]，而MUC6可能通過阻礙腫瘤細胞侵襲胰管基底膜從而發(fā)揮保護因子的作用[19]。本研究的結(jié)果也證實了這一觀點，我們發(fā)現(xiàn)，盡管單獨的MUC6狀態(tài)與預后無顯著相關(guān)性，但在MUC1表達相同的情況下，MUC6高表達的患者比MUC6低表達的患者有更長的總生存期。通過差異表達基因富集分析發(fā)現(xiàn)，MUC1、MUC4和MUC6主要通過與胞膜致癌信號受體相互作用或參與誘導離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白異常或通過創(chuàng)造空間位阻掩蓋腫瘤相關(guān)表位以防止免疫細胞對腫瘤細胞的特異性和非特異性殺傷效應(yīng)而影響PAAD疾病進程[33-36]。3種黏蛋白的顯著相關(guān)差異表達基因之間沒有交集，但是MUC1和MUC4之間有一些重疊，提示在疾病進展中的疊加效應(yīng)或功能互補，然而，其精確的分子間及與下游級聯(lián)分子間相互作用還需要進一步研究確定。

總之，我們的研究表明，MUC1、MUC4和MUC6在PAAD腫瘤組織中表達異常，MUC1蛋白非極化表達和MUC4高表達提示PAAD患者預后不佳，MUC1、MUC4和MUC6組合對PAAD預后具有分層意義，3種黏蛋白可能通過疊加效應(yīng)或功能互補促進PAAD疾病進程，不僅有望成為PAAD患者重要的預后指標，而且為進一步研究其潛在的分子機制提供線索。