海參肽的應(yīng)用研究進展

霍韻瀅，葉加蘭，吳若彤，張鑫清，郭雅欣，顏大昌， 羅瑋鵬，林小妍，張可琪，陳 忻，許 鋒

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 佛山 528000)

海參也稱為海參，海茄子，是一種海洋無脊椎動物，屬于棘皮動物門、海參綱。海參不僅富含蛋白質(zhì)，各種微量元素，必需氨基酸，維生素等，而且還包含許多生物活性物質(zhì)，例如海參多糖，膠原蛋白，海參皂苷，海參肽和腦苷脂[1]。它對腫瘤，抗真菌，抗凝血，降低血壓，降低血脂和增強人體的免疫功能具有良好的作用[2]。其中，生物活性肽對人體健康的影響備受關(guān)注，其在生物體中的提取及其在人體中的應(yīng)用已成為研究人員關(guān)注的焦點。海參經(jīng)過蛋白水解可以得到海參肽，具有良好的溶解性，穩(wěn)定性和低粘度，具有很大的應(yīng)用潛力。但目前國內(nèi)外關(guān)于海參肽的報道較少且應(yīng)用領(lǐng)域較少。本文將簡要介紹海參肽的特性和提取工藝，為海參肽在功能性食品，藥品，化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 海參肽的分離提取及純化工藝研究進展

1.1 海參肽的分離提取工藝

海參肽是以新鮮海參作為原料，在經(jīng)過蛋白酶酶解等過程，分離純化后得到由2～12個氨基酸組成的小分子肽或是分子量更大的多肽，其中分子質(zhì)量低于2000 U的組分占90%以上，提取出來的海參肽是具有溶解性良好、穩(wěn)定性、容易吸收消化等優(yōu)點的活性肽[3]。研究表明海參肽具有抗氧化性作用、ACE抑制活性及降血壓作用、延緩衰老、對糖尿病的預(yù)防和緩解作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抗疲勞作用、抗腫瘤作用等作用?，F(xiàn)如今，海參肽在功能性食品、護膚品、藥品等行業(yè)的應(yīng)用極為廣泛。

目前海參肽的提取以蛋白酶提取法為主。楊東達等[4]考察不同蛋白酶的酶解效果時，以蛋白水解度和酶解液中海參肽相對分子質(zhì)量的分布作為指標(biāo)，以篩選出水解提取海參內(nèi)臟多肽最適合的蛋白酶，并通過單因素實驗的基礎(chǔ)上采用正交實驗優(yōu)化酶解工藝。優(yōu)化后的提取方法表明，可用于水解海參內(nèi)臟制備海參肽。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，加酶量為0.3751 mkat·g-1，pH值為8.0，酶解溫度為37 ℃，水解時間為5 h的最優(yōu)酶解條件下，胰蛋白酶的水解效果最佳，其水解度可達到48.90%，寡肽(含氨基酸)(2000 U)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.2，所得海參多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.68%，酶解液中的多肽(2000～5000 U)。

史亞萍等[5]以水解度為指標(biāo),試驗研究了多種蛋白酶對海參蛋白的水解能力的影響,確定以復(fù)合蛋白酶酶解效果最佳。通過響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化后:(加酶量0.79%、料液比1:5.35(g/mL)、酶解時間3.93 h)在此條件下, 所得該酶最佳酶解條件最佳，海參蛋白水解度達到21.38%。分別用截留分子量3 kDa和1 kDa超濾膜對海參肽進行分級分離,得到三種海參肽(分子量大于3 kDa, 1～3 kDa和小于1 kDa)。

1.2 海參肽的純化

海參肽分離純化技術(shù)目前主要方法為化學(xué)試劑法、超濾技術(shù)、凝膠過濾柱層析法、電泳法等方面。目前對海參肽進行脫鹽、脫色、脫腥的主要純化方法有離子交換柱層析法、超濾法、透析法等。實驗中會根據(jù)需分離提純的活性物性質(zhì)，將多種分離方法進行結(jié)合，從而達到更好的分離提純效果。

化學(xué)試劑法是利用不同活性物在不同濃度的化學(xué)試劑中溶解度不同，達到逐步分離提純效果，過程較為繁瑣復(fù)雜。

(1)超濾法是在一定壓力下，利用分子大小不同，通過加壓使海參肽酶解液通過超濾膜的過濾方法，通過超濾膜的則為濾過液，被截留的高分子物質(zhì)則為截留液，從而實現(xiàn)對海參肽中不同活性成分進行分離提取，具有常溫操作、不破壞熱敏活性物活性、防止活性物無相態(tài)變化等優(yōu)點，對不同分子量的活性物進行分離的膜分離技術(shù)。

(2)凝膠過濾柱層析法又稱凝膠過濾色譜法、分子篩層析法。利用不同固定相對不同物質(zhì)的滯留效果不同，從而實現(xiàn)分離提純的方法。大分子量的海參肽活性物質(zhì)會從凝膠空隙中流出，流出速度相對較快，小分子量的進入凝膠孔徑內(nèi)部，受阻滯作用大，流出速度相對較慢最后被洗脫下來。凝膠過濾柱層析法操作簡單，分離效果好，不會對海參肽活性物質(zhì)造成損害，所以在多肽多糖分離提取實驗中應(yīng)用范圍較廣。

(3)電泳分離法利用在電場中不同物質(zhì)的遷移速度不同，從而實現(xiàn)分離，這種方法具有快速高靈敏等優(yōu)點。離子交換柱層析法等。實驗中會根據(jù)需分離提純的活性物性質(zhì)，將多種分離方法進行結(jié)合，從而達到更好的分離提純效果。

2 海參肽的理化特性及功能特性

2.1 抗氧化性作用

每個人在正常的生理代謝過程中，都會產(chǎn)生含氧自由基，而含氧自由基主要包括羥基自由基(最活躍的自由基)、過氧化羥基自由基(產(chǎn)生破壞性極大的自由基)、超氧陰離子(發(fā)現(xiàn)最早也是人體含量最多的自由基)等，人體在正常的生理代謝過程中產(chǎn)生的自由基總處于動態(tài)平衡，在體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生與清除。當(dāng)人體遭到損傷時，組織處于缺氧的狀態(tài)，能量代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化體系出現(xiàn)故障，從而自由基產(chǎn)生過多，會破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，同時可能會破壞體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)；人體內(nèi)氧自由基積累越多，衰老的進程就越快。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)海參多肽可以提高體內(nèi)的抗氧化酶的酶活性。王靜等[6]研究海參多肽的抗氧化性能發(fā)現(xiàn)，海參多肽的抗氧化性均優(yōu)于天然抗氧化劑維生素C，并且研究發(fā)現(xiàn)海參肽的抗氧化性與分子量大小有密切關(guān)聯(lián)，不同分子量范圍的海參肽清除氧自由基的能力不同。侯付景等[7]研究發(fā)現(xiàn)海地瓜水解液使小鼠血清和肝臟組織中的SOD,GSH-Px活力明顯提高,丙二醇含量顯著降低，得出結(jié)論海地瓜酶水解液具有良好的抗氧化作用，能有效清除體內(nèi)堆積的自由基。

2.2 ACE抑制活性及降血壓作用

隨著人們生活水平的改善提高，人們對高蛋白、高脂肪物質(zhì)的攝入也越來越多，三高人群日益增長，從而導(dǎo)致高血壓成為最常見的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險因素。而血管緊張素酶(Angiotensin-converting enzyme inhibition，ACE)是調(diào)節(jié)血壓的關(guān)鍵酶，它將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有強烈收縮血管功能的血管緊張素Ⅱ，從而鈍化舒緩激酶，使血壓升高[8]。海參肽能抑制ACE活性，通過抑制血漿和血管內(nèi)皮細胞ACE的活性從而達到降低血壓。趙元暉等[9]以低值的食用海參——海地瓜為原料，采用復(fù)合酶水解工藝和超濾技術(shù)，把水解產(chǎn)物分級為大于2 kDa和小于2 kDa的兩種組分。其中小于2 kDa的組分具有很強的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給腎血管性高壓大鼠灌喂該組分一個月后，測得大鼠舒張壓和收縮壓明顯下降，且呈劑量依賴性。說明小于2 kDa的水解液不但在體外能抑制ACE的活性，在體內(nèi)也具有抗高血壓的效果，證實了海參具有降血壓活性物質(zhì)。

2.3 延緩衰老

隨著年齡的增長，機體衰老是不可避免的，機體衰老會導(dǎo)致皮膚細胞增殖減少、表皮更新速度減慢、表皮重建功能減弱、真皮膠原合成減慢，周婷等[10]研究發(fā)現(xiàn)海參肽對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠具有提高免疫和增強抗氧化能力的作用，能夠延緩衰老。柴玉超等[11]研究了海參肽對成纖維細胞的作用并與市面上常見化妝品抗皺成分如燕麥多肽、蝸牛原液、中草藥復(fù)合液(含有白芨、白術(shù)、當(dāng)歸、人參)等進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海參肽比其他三種成分更明顯的促進成纖維細胞NIH/3T3的生長，增殖率達到33.9%，分別比燕麥多肽、蝸牛原液和中草藥復(fù)合液高14.2%、26.7%和26.2%，由此可見，海參多肽可以作為主要的功能材料，能明顯提高化妝品的抗皺修復(fù)效果，延緩皮膚的衰老，其在化妝品中的應(yīng)用前景廣闊。王歡[12]研究表明海參酶解物能促進成纖維細胞增殖及細胞膠原蛋白分泌的作用。

2.4 對糖尿病的預(yù)防和緩解作用

董麗莎等[13]以Ⅰ、Ⅱ型糖尿病大鼠為模型，適應(yīng)性飼養(yǎng)一段時間后，將大鼠分為預(yù)防組與治療組，空腹注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin STZ)建立糖尿病大鼠模型，以此測定各組大鼠的空腹血糖、糖化血清蛋白、組織等生化指標(biāo)。結(jié)果表明，仿刺參和海地瓜兩種海參肽均可顯著改善Ⅰ、Ⅱ型糖尿病大鼠的糖、脂代謝等指標(biāo)，達到對糖尿病預(yù)防和緩解的作用。高血糖是糖尿病腎病的引發(fā)因素，其可以通過多種途徑和方式來損傷腎臟。因此為了預(yù)防糖尿病的發(fā)生，控制血糖水平是關(guān)鍵。而海參多肽中有顯著的降血糖功效，能較好地控制血糖水平。

2.5 免疫調(diào)節(jié)作用

通過多個動物實驗表明，海參肽能夠顯著提高機體免疫功能。盧連華等[14]使用0.085、0.170、0.500 g/kg的海參肽，通過連續(xù)30天灌胃小鼠，結(jié)果表明海參肽可以促進小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細胞增殖能力，明顯增強小鼠的溶血空斑數(shù)和血清溶血素水平，及巨噬細胞對雞紅細胞吞噬率、吞噬指數(shù)和碳廓清指數(shù)，說明適量海參肽有促進細胞免疫和體液免疫的功能，和增強單核巨噬細胞的活性。趙芹等[15]的研究結(jié)果表明美國肉參、墨西哥刺參和冰島刺參均能明顯提高小鼠胸腺/體質(zhì)量比值，促進小鼠脾淋巴細胞的增殖和轉(zhuǎn)化，提高小鼠血清溶血素含量及巨噬細胞對血液中碳粒的吞噬指數(shù)。練方亮[16]初步分析了海參多肽可能是通過活化 CD3ζ和ZAP-70介導(dǎo)的TCR信號通路來增強小鼠的免疫功能。羅文奇[17]進一步研究了海參肽對小鼠巨噬細胞的免疫作用機制，結(jié)果表明海參肽可增強小鼠單核巨噬細胞免疫活性,對細胞無毒性作用。主要作用機制是海參肽通過激活NF-κB信號通路與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,促進腫瘤壞死因子(TNF-α)、和白細胞介素6(IL-6)分泌,從而發(fā)揮促免疫活性，且劑量越高，分泌的細胞因子越多。

2.6 抗疲勞作用

由運動引起的疲勞，機體會產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)從而導(dǎo)致肌肉承受能力降低[18-19]。疲勞評價方法主要有運動耐力試驗和生化指標(biāo)檢測。生化指標(biāo)主要有3種:①代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)(酶、激素)②代謝產(chǎn)物(血和肌肉中的乳酸、氫離子濃度、丙酮酸、血尿素氮)③能量物質(zhì)(血糖、肝糖原、肌糖原、磷酸肌酸等)。運動耐力的提高是抗疲勞能力增強最直接、客觀的指標(biāo)[20]。盧連華等[14]以灌胃方式給小鼠0.085、0.170、0.500 g/kg的海參肽，結(jié)果表明：海參肽可顯著延長小鼠的負(fù)重游泳時間；顯著降低運動后小鼠的血清尿素氮含量和血乳酸水平；顯著提高肝糖原的含量，表明適量海參肽具有較強的抗疲勞作用。郭光明[21]進一步分析了以海參小分子肽按2 mg/100 g體重劑量灌胃小白鼠，檢測其骨骼肌中的丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶的活性，結(jié)果顯示海參肽可以顯著提高了三種酶的活性水平，但是具體機制尚不明確。王祖哲等[22]研究表明：刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉均有抗疲勞作用，其抗疲勞作用強弱順序為:刺參低聚肽>大豆低聚肽>海參粉,。相對于已經(jīng)在保健品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的大豆肽，提示抗疲勞效果更好的刺參肽可作為保健品和功能食品的原料，且研究發(fā)現(xiàn)刺參低聚肽的使用劑量與抗疲勞效應(yīng)不存在正相關(guān)，服用適量的劑量(約為0.8 g/d)刺參低聚肽產(chǎn)品可起到明顯的抗疲勞作用。何傳波等[23]也證明海參內(nèi)臟酶解物具有抗疲勞效果，適量的海參內(nèi)臟酶解物可以使抗疲勞表現(xiàn)最大化。王敏等[24]研究發(fā)現(xiàn)海參肽復(fù)合物(與瑪咖粉、枸杞子提取物、紅景天提取物配伍)相對于植物提取物和海參肽，緩解體力疲勞的作用更好佳。上述海參肽的動物實驗表明，適量的補充海參肽可以提高抗疲勞作用，為開發(fā)抗疲勞的保健品和功能食品提供了可能性。

2.7 抗腫瘤作用

海參肽能有效抑制腫瘤細胞細胞活力，對腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。王奕[25]使用日本刺參勻漿對移植性腫瘤模型小鼠進行灌胃處理，以探討日本刺參多肽的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用。結(jié)果顯示,不同劑量組的日本刺參肽都能明顯抑制小鼠S180肉瘤的生長,并能提高小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05)。表明日本刺參具有調(diào)節(jié)機體特異性和非特異性免疫的功能，能夠控制和殺滅腫瘤細胞。Zhou Xiaoqiu等[26]通過超濾膜分離得到兩種低分子質(zhì)量海參肽，LSCP-1和LSCP-2，對其抗腫瘤活性進行體外研究分析。研究顯示，雖然這兩個片段并未顯示抗A549細胞株的活性，但是LSCP-1能明顯抑制胃癌SGC-7901細胞活性，LSCP-2能明顯抑制SGC-7901和人乳腺癌MCF-7細胞活性，提示小分子質(zhì)量海參肽有可能作為治療胃癌和乳腺癌的藥物原料。孫姿姿等[27]研究葉瓜參多肽對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤效果，結(jié)果表明葉瓜參多肽可以通過降低腫瘤細胞的活力和腫瘤細胞的生長和繁殖速度來抑制腫瘤細胞的生長。原程華[28]進一步確認(rèn)了具有腫瘤抑制功能的基因片段，人工合成的基因片段表達出的rAj-Tspin肽在體外具有抑制黑色素瘤B16細胞的生物活性。

3 海參肽的應(yīng)用研究進展

3.1 應(yīng)用于功能性食品領(lǐng)域

海參自古就被認(rèn)為是質(zhì)佳的營養(yǎng)保健食品，有增強肌肉力量，調(diào)節(jié)免疫力，預(yù)防關(guān)節(jié)炎，貧血和陽痿的功效[29]，除此之外，還有調(diào)節(jié)血壓和抗疲勞的功能，故海參肽也廣泛應(yīng)用于功能性食品中。于雁飛[30]等利用運動性疲勞大鼠模型探究海參肽對骨骼肌線粒體功能的影響，結(jié)果表明，與空白組對比，海參肽高中低組SOD、GPx活性升高，MDA含量降低，骨骼肌PTP開放程度減弱；線粒體線粒體復(fù)合物Ⅰ，Ⅲ活性提高(P<0.05或<0.01);骨骼肌線粒體PGC-1α，ERR表達增加(P<0.05或<0.01)。結(jié)論海參肽可以改善運動性疲勞大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低骨骼肌線粒體腫脹膨脹度和線粒體膜通透性，增強骨骼肌線粒體的呼吸功能，上調(diào)線粒體生成轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α和ERR的表達。因此認(rèn)為海參肽具有抗疲勞和增強肌肉的作用。徐先鋒等[31]通過喂食小叔冰島刺身多肽實驗也表明，海參多肽對小鼠DTH(DTH反應(yīng)是由效應(yīng)性T細胞與相應(yīng)抗原作用后，引起的反應(yīng)為單核細胞浸潤和組織細胞損傷為特征的炎癥反應(yīng))有極顯著影響，對免疫球蛋白含量也有顯著影響，從而為海參肽應(yīng)用于免疫食品提供堅實理論基礎(chǔ)。

3.2 應(yīng)用于護膚品領(lǐng)域

柴玉超等[11]對海參肽成纖維細胞的作用進行了研究，并與市面上常見化妝品抗皺成分如燕麥多肽、蝸牛原液、中草藥復(fù)合液(含有白芨、白術(shù)、當(dāng)歸、人參)等進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海參肽可以顯著促進成纖維細胞NIH/3T3的生長，增殖率在實驗中高達33.9%，位于第一位，以此確定海參膠原具有延緩皮膚衰老的功效。Zhou Xiaoqiu等[32]的實驗證實低分子質(zhì)量的海參肽在清除自由基方面有著重要作用。曹學(xué)彬等[33]分別用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶酶解海參蛋白，發(fā)現(xiàn)這幾種酶中酶解得到的海參肽清除超氧陰離子的活性最高的是胰蛋白酶，而木瓜蛋白酶酶解得到的海參肽清除羥自由基的活性最高，酸性蛋白酶酶解得到的海參肽還原能力最強，經(jīng)過對比確認(rèn)胰蛋白酶酶解得到的海參肽具有最好的綜合抗氧化能力。

3.3 應(yīng)用于藥物領(lǐng)域

海參多肽具有多種生理學(xué)功能，包括抗氧化、抗炎和抗菌等。陳婭等[34]研究發(fā)現(xiàn)使用一線抗結(jié)核藥品利福平(RFP)和異煙肼(INH)會對小鼠肝組織造成損傷，而使用海參膠原低聚肽可以明顯改善使用一線抗結(jié)核藥品產(chǎn)生的副作用。周婷[9]等利用D-半乳糖衰老模型小鼠進行海參肽對此模型小鼠的抗氧化和免疫功能的影響研究發(fā)現(xiàn)，相比較空白組，海參肽高劑量組小鼠的生理學(xué)數(shù)據(jù)表明海參肽對D-半乳糖衰老模型的小鼠具有提高抗氧和免疫功能能力。李林[35]觀察海參膠原低聚肽對Ⅱ型糖尿病小鼠傷口的愈合作用，通過觀測不同時期傷口的愈合情況，生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與模型組小鼠對比，實驗組的小鼠傷口愈合較好，因此，海參膠原低聚肽能夠改善小鼠傷口營養(yǎng)狀況，能夠促進傷口愈合。

4 結(jié) 語

近年來，生物活性肽對人體健康的保健作用越來越受到重視，但相關(guān)研究仍處于基礎(chǔ)研究和初步的臨床研究階段。海參中蛋白水解后制備的海參多肽，受到越來越多研究人員的關(guān)注。本文介紹了海參的生物活性、開發(fā)及應(yīng)用進展。海參的生物活性主要有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)作用、抗疲勞、抗腫瘤、延緩衰老和對糖尿病的預(yù)防和緩解作用，對人體健康保健具有可視作用。我們應(yīng)深入研究海參肽的結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系、海參肽活性作用機制等，使海參肽能夠在功能食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)開發(fā)等方面有更廣闊的前景。