揚州茱萸灣風(fēng)景區(qū)森林土壤細菌多樣性研究

萬 欣，王 磊*，李文斌，江 浩

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.江蘇揚州城市森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，江蘇 揚州 225000；3.揚州市茱萸灣風(fēng)景區(qū)管理處，江蘇 揚州 225000 )

隨著人們對城市森林生態(tài)環(huán)境的關(guān)注,對城市森林的生物多樣性研究工作日益重視。土壤中的微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和具有決定性影響的組分之一[1-2]。已有研究表明，森林土壤微生物群落作為分解者、共生體或病原體，在調(diào)節(jié)生物地球化學(xué)循環(huán)方面起到關(guān)鍵作用[3-4]。土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)特征是表征森林土壤環(huán)境質(zhì)量變化的最敏感、最有潛力的指標(biāo)，其種群、數(shù)量、分布及多樣性等群落結(jié)構(gòu)特征可直接或間接地影響森林土壤的基本理化性質(zhì)，進而影響森林樹木的生長發(fā)育[5-8]。因此，研究土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性在評價各種因素(包括自然因素和人為因素)干擾導(dǎo)致的森林土壤質(zhì)量變化方面起著重要的指示作用。

本研究選取揚州市茱萸灣風(fēng)景區(qū)內(nèi)6種不同植被類型的城市森林作為研究對象，對不同植被類型下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性指數(shù)進行比較研究，以期為該地區(qū)城市森林生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能的保護、合理利用土壤、營造最佳生態(tài)效益的林分、防止地力衰退提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

本研究地點設(shè)在揚州市廣陵區(qū)茱萸灣風(fēng)景區(qū)內(nèi)，是江蘇揚州市城市生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站的主站點。該區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)性濕潤氣候向溫帶季風(fēng)氣候的過渡區(qū)，平均海拔2 m，年均氣溫15.8 ℃，年均降水量864 mm。該區(qū)域的植被為地帶性次生林植被，林分生長良好，在長江下游平原水網(wǎng)地區(qū)具有典型性和代表性。經(jīng)實地調(diào)查取點，確定6個不同植被種類的城市森林樣地作為本研究的研究樣點，每個樣點各設(shè)置樣地1個。樣地的具體位置和概況見表1。

表1 樣地概況

1.2 土壤樣品采集和處理

在每個樣地內(nèi)的四角與中心選取5個采樣點，將表面的腐殖質(zhì)層移除后，用土鉆采集土壤深度0—20 cm的土層，挑出凋落物、細根和小石塊等雜物后充分混合，以減少異質(zhì)性帶來的影響。土壤樣品過2 mm尼龍篩放入自封袋密封，以備測定土壤細菌群落多樣性[9]。

1.3 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性測定[10]

稱取0.5 g新鮮土樣，按照美國強力土壤試劑盒的說明書來提取土壤細菌DNA。設(shè)計16Sv3-v4區(qū)特定引物擴增特異區(qū)域，得到420 bp左右擴增片段。加接頭，采用Hiseq 2500平臺，測序得到2×300 bp的paired-end數(shù)據(jù)，通過拼接，可以得到較長序列，從而進行16 S分析[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(Dirty Data)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTU聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對每個OTU的序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、花瓣圖分析，以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息。然后使用SPSS17.0軟件采用Pearson法進行相關(guān)性分析(0.05水平)[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測序結(jié)果

土壤樣品通過優(yōu)化過濾低質(zhì)量序列后得到有效序列總數(shù)為36 913條，土壤樣品序列經(jīng)拆分、去冗余后在97% 相似度下進行OTUs聚類共得到1 946個OTUs。為了考察指定樣品間的基因數(shù)目分布情況，分析不同樣品之間的基因共有和特有信息，繪制了花瓣圖。由圖1所見，在97%的相似水平上統(tǒng)計得到樣地土壤細菌212個，約占OTU總數(shù)的10.89%，3號茱萸林獨有的土壤細菌的OTU數(shù)目最多有83個，約占總數(shù)的4.27%。由此可見，3號山茱萸林與其他森林群落土壤細菌的OTUs分布差異較大。

注：花瓣圖中每個花瓣代表一個樣地的樣本(分別用S1—S6表示)，不同的顏色代表不同的樣地的樣本，中間的core數(shù)字代表的是所有樣地的樣本中共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣地樣本特有的OTU數(shù)目。圖1 不同植被類型下土壤細菌OTU花瓣圖

2.2 土壤細菌多樣性指數(shù)

物種多樣性的分析包含樣品中的物種組成的豐富度和均勻度2個因素，通常用Observed Species指數(shù)、Chao指數(shù)，Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等指數(shù)來評估樣本的物種多樣性，指數(shù)越高，表明樣本的多樣性越復(fù)雜[14]。Observed Species指數(shù)和Chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，即群落中物種的數(shù)量。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性[15-16]。通過測序，6種植被類型森林土壤測序的幾種多樣性指數(shù)由表2所示。

表2 97%條件下各林型土樣多樣性指數(shù)

由表2可知，6個林型的土壤測序的Coverage指數(shù)均在0.995以上，說明該試驗的測序結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映供試土壤樣品的真實情況。6個林型土壤樣本中，Chao1指數(shù)和Observed Species指數(shù)以2號水杉林最高，說明該林型的土壤細菌的物種總數(shù)、菌群豐度和復(fù)雜度最高，其次是1號竹林和3號茱萸林。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也是以2號水杉林最高，說明該林型的土壤細菌群落的均勻度最高，其次是1號竹林和6號雜闊林。

2.3 土壤細菌相對豐度

在門分類水平上，相對豐度前20的物種聚類分析圖如圖2所示。其中，相對豐度平均值大于1%的優(yōu)勢菌門有11個，其相對豐度值見表3。

圖2 門分類水平Top20物種相對豐度聚類圖

表3 11種優(yōu)勢菌門在不同林分土壤中的相對豐度值 %

由表3可知，1號竹林(S1)、2號水杉林(S2)、4號雜闊林(S4)、6號雜闊林(S6)的土壤中變形菌(Proteobacteria)相對豐度最高，分別為38.15%,33.54%,44.25%,30.66%，其次是酸桿菌(Acidobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、厚壁菌(Firmicutes)；3號茱萸林(S3)和5號松柏林(S5)土壤中厚壁菌相對豐度最高，分別是42.09%和41.14%，其次是變形菌、酸桿菌、綠彎菌。

為了進一步分析各林型土壤細菌群落多樣性差異，本研究基于Weighted Unifrac距離來進行PCoA分析。圖3為PCoA對6種林型土壤樣本的土壤細菌群落多樣性的分析結(jié)果，如果2個樣本距離較近，則表示這2個樣本的物種組成較相近。

注：橫坐標(biāo)表示第1主坐標(biāo)，百分比則表示第一主坐標(biāo)對樣本差異的貢獻率；縱坐標(biāo)表示第2主坐標(biāo)，百分比表示第2主坐標(biāo)對樣本差異的貢獻率。圖中點分別表示各個樣本。S1-S6表示6種不同林型的樣本。 圖3 PCoA分析圖

由圖3可見，3號山茱萸林(S3)和1號竹林(S1)與其他林型的土壤樣本距離較遠，說明這2種林型的物種組成與其他4種林型的土壤細菌的物種組成有明顯差異。其他4個林型的土壤樣本距離較近，說明這4種林型的土壤細菌的物種組成無明顯差異。

3 結(jié)論與展望

由此可見，揚州茱萸灣風(fēng)景區(qū)內(nèi)水杉林土壤細菌的物種總數(shù)、菌群豐度和復(fù)雜度最高，其次是竹林和茱萸林。水杉林的土壤細菌群落的均勻度最高，其次是竹林和雜闊林。山茱萸林獨有的土壤細菌的OTU數(shù)目最多，與其他森林群落土壤細菌的OTUs分布差異較大；在門分類水平上，該地區(qū)相對豐度平均值大于1%的優(yōu)勢菌門有11個。

為深入研究城市森林土壤微生物群落在生態(tài)系統(tǒng)過程中的作用，希望在進一步研究中針對土壤微生物多樣性、土壤理化指標(biāo)和大氣環(huán)境因子進行同步監(jiān)測，研究大氣環(huán)境-土壤-微生物之間的相關(guān)性，對于預(yù)測城市森林對未來環(huán)境條件的響應(yīng)至關(guān)重要。