柳樹種質(zhì)核DNA含量的流式測(cè)定

何旭東，鄭紀(jì)偉，王 宇，教忠意，諸葛強(qiáng)

(1. 江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153； 2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)柳樹資源圃，江蘇 南京 211153;3. 南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

基因組大小是生物最基本的特征之一，通常用未復(fù)制的單倍體或配子細(xì)胞核DNA的總含量來估算，即C值(C-value)，一般用皮克(10-12g)表示[1]。DNA含量C值的研究意義重大，特別是在細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、分子生物學(xué)、分類學(xué)、生理學(xué)與古生物學(xué)等研究領(lǐng)域[2-4]。近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)，C值還與種子質(zhì)量、光合速率、葉細(xì)胞大小、氣孔密度、基因組進(jìn)化模式等存在一定的相關(guān)性[5]。Bennett等[6]建立了植物C值數(shù)據(jù)庫(https:∥cvalues.science.kew.org)，截止目前共收錄了12 273 個(gè)物種核DNA含量的C值信息，包括被子植物類、裸子植物類、蕨類、苔蘚類和藻類。不同植物間C值差異較大，已知幾種藻類如紅藻(Galdieriasulphuraria)、微藻(Ostreococcustauri)、類藍(lán)藻(Cyanidiumcaldarium)的C值最小，只有0.01 pg，最大的為日本重樓(Parisjaponica)，C值達(dá)到152.23 pg。

柳樹屬楊柳科(Salicaceae)，通常指鉆天柳屬(Chosenia)和柳屬(Salix)包含的所有樹種。全世界柳樹有500種以上，而中國是柳樹的分布中心，據(jù)中國植物志記載，我國有柳樹257種，其中2/3為灌木柳。自古以來，柳樹是我國重要的園林綠化樹種，也是不可或缺的防護(hù)及用材樹種[7]。在北美及歐洲，柳樹還被廣泛用于生物質(zhì)能源[8]。柳樹生長迅速、繁殖容易、基因組大小適中，是木本植物開展遺傳學(xué)與基因組學(xué)研究的理想模式樹種[9]。由于柳樹種類繁多、變異豐富、種間及種內(nèi)雜交極為容易，導(dǎo)致其系統(tǒng)分類極為復(fù)雜，迄今為止國內(nèi)外學(xué)者仍有較大爭(zhēng)議。根據(jù)植物C值數(shù)據(jù)庫查詢，目前國外僅有15份(14個(gè)種)的柳樹C值檢測(cè)結(jié)果，占柳樹總數(shù)量的3%不到，而國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道(見表1)。鑒于此，本研究利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)22份柳樹不同種質(zhì)的核DNA含量，并估算其基因組大小，旨在為柳樹系統(tǒng)分類、細(xì)胞生物學(xué)及基因組學(xué)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與標(biāo)樣

本研究試驗(yàn)材料包含柳樹14個(gè)自然種和8個(gè)品種，共計(jì)22份種質(zhì)材料，其中喬木柳10份，灌木柳12份(見表2)。所有植株均定植于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹種質(zhì)資源圃內(nèi)。采集各植株幼嫩葉片備用。大豆(Glycinemax，1C=1.13 pg)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，在本試驗(yàn)中作為灌木柳樣品的內(nèi)標(biāo)；水稻日本晴(Oryzasativasubsp.Japonica‘Nipponbare’, 1C = 0.397 5 pg)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)，在本試驗(yàn)中作為喬木柳樣品的內(nèi)標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解離液與熒光染料 選用LB01為解離液，具體配方為：15 mmol/L Tris, 2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L 四鹽酸精胺，20 mmol/L NaCl，80 mmol/L KCl，0.1%(V/V)TritonX-100，pH值為7.0—8.0；選用終濃度為50 μg/mL的碘化丙啶(PI)為熒光染料。均于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 已發(fā)表的柳樹不同個(gè)體核DNA含量(1C值)

1.2.2 細(xì)胞核懸液制備與染色 各取1 g左右待測(cè)樣品及內(nèi)標(biāo)材料幼嫩葉片置于培養(yǎng)皿中，加入1 mL LB01解離液，用刀片快速切碎葉片。吸取上清液于400目濾網(wǎng)過濾，置于冰上孵育5 min，4 ℃，1 000 r/min離心5 min。吸取上清并加入10 μg/mL的RNase，隨后加入0.5 μL PI熒光染料，混勻后置于冰上避光孵育20 min上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 上機(jī)檢測(cè) 流式細(xì)胞儀為美國BD公司的Influx系統(tǒng)，熒光激發(fā)波長為488 nm，低速檢測(cè)，每次收集顆粒10 000個(gè)。先分別以大豆和水稻單獨(dú)上機(jī)檢測(cè)，記錄相對(duì)熒光強(qiáng)度范圍。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。變異系數(shù)(CV)控制在5%以內(nèi)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用流式細(xì)胞儀自帶軟件FACSTM Software進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。待測(cè)樣品核DNA含量(1C值)計(jì)算表達(dá)式為(待測(cè)樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度 / 標(biāo)樣G0/G1峰熒光強(qiáng)度)×標(biāo)樣細(xì)胞核DNA含量(1C值)[5]。DNA含量與基因組大小換算表達(dá)式為1 pg DNA=978 M bp[15]。利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣熒光范圍的確定

為減小試驗(yàn)誤差，本研究采用待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)混合測(cè)定的方法進(jìn)行檢測(cè)?；旌蠙z測(cè)前，單獨(dú)對(duì)內(nèi)標(biāo)進(jìn)行上樣檢測(cè)。結(jié)果表明：水稻‘日本晴’的熒光強(qiáng)度在10 000附近，大豆熒光強(qiáng)度在22 000附近。經(jīng)查詢，已發(fā)表的灌木柳自然種基因組C值為0.4 pg左右，喬木柳自然種基因組C值為0.8 pg左右(見表1)。由于核DNA含量與熒光強(qiáng)度成正比，為使待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)熒光強(qiáng)度峰值能有效區(qū)分，因此選擇水稻為喬木柳待測(cè)樣品內(nèi)標(biāo)，且樣品峰位于內(nèi)標(biāo)峰的右側(cè)；選擇大豆為灌木柳待測(cè)樣品內(nèi)標(biāo)，且樣品峰位于內(nèi)標(biāo)峰的左側(cè)。

2.2 基因組C值的測(cè)定

分別將22個(gè)柳樹待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)混合上機(jī)，檢測(cè)結(jié)果如圖1，2所示，樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰清晰且無重疊，區(qū)分度較好，表明本試驗(yàn)結(jié)果可靠。經(jīng)系統(tǒng)自帶軟件收集數(shù)據(jù)并經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，得到22個(gè)個(gè)體的核DNA含量與基因組大小值(見表3)。

圖1 部分喬木柳種質(zhì)與內(nèi)標(biāo)水稻‘日本晴’混合上樣檢測(cè)結(jié)果

圖2 部分灌木柳種質(zhì)與內(nèi)標(biāo)大豆混合上樣檢測(cè)結(jié)果

表2 試驗(yàn)材料

按自然種與品種不同類型分析，自然種中，龍爪柳核DNA含量1C值最大，為0.67 pg，基因組大小為660 M bp；其次為垂柳，核DNA含量1C值為0.60 pg，基因組大小為582 M bp；蒿柳核DNA含量1C值最小，為0.38 pg，基因組大小為369 M bp。品種中，蘇柳932核DNA含量1C值最大，為0.90 pg，基因組大小為876 M bp；其次為蘇柳1011，核DNA含量1C值為0.87 pg，基因組大小為847 M bp；蘇柳1053最小，核DNA含量1C值為0.39 pg，基因組大小為385 M bp。

按喬木柳與灌木柳不同類型分析，喬木柳中，蘇柳932核DNA含量1C值最大，其次為蘇柳1011，粉枝柳核DNA含量1C值最小，為0.43 pg，基因組大小為417 M bp。灌木柳中，灰柳核DNA含量1C值最大，為0.60 pg，基因組大小為588 M bp；其次為歐洲紅皮柳，核DNA含量1C值為0.47 pg，基因組大小為459 M bp；蒿柳核DNA含量1C值最小。

2.3 基因組C值的比較

多重比較分析表明：柳樹大部分個(gè)體間核DNA含量1C值存在顯著差異(P<0.05)，部分個(gè)體間沒有顯著性差異，如垂柳、灰柳與蘇柳795，細(xì)柱柳、銀柳、蘇柳2345、蘇柳52-2與蘇柳9-6(見表3)。進(jìn)一步將22個(gè)個(gè)體劃分成喬木柳和灌木柳2個(gè)組，方差分析結(jié)果表明：喬木柳和灌木柳組間存在極顯著差異(P<0.01，見表4)。

3 結(jié)論與討論

早期的研究認(rèn)為，物種的DNA C值具有特異性，是恒定不變的，但隨著樣本來源的多樣化及檢測(cè)量的增加，越來越多的研究表明同一物種的不同個(gè)體間DNA C值也存在一定的差異[16]。本研究選取的22個(gè)待測(cè)樣本中，有5個(gè)與C值數(shù)據(jù)庫中已公布的種相同。其中，蒿柳(0.38 pg)和歐洲紅皮柳(0.47 pg)與數(shù)據(jù)庫中公布的C值數(shù)據(jù)差異不大(蒿柳0.41 pg，歐洲紅皮柳0.43 pg)，但垂柳(0.60 pg)、白柳(0.59 pg)和灰柳(0.60 pg)與數(shù)據(jù)庫中公布的C值數(shù)據(jù)差異較大(垂柳0.77 pg，白柳0.83 pg，灰柳0.85 pg)。類似的結(jié)論在木蘭科[17]及鳶尾屬[18]的研究中也所有發(fā)現(xiàn)。推測(cè)其原因，最主要的可能是由于林木世代周期長、高度雜合而引起遺傳背景的差異而導(dǎo)致。此外，不同的氣候條件、生態(tài)環(huán)境、種群大小、發(fā)育階段、取樣部位等也可能導(dǎo)致檢測(cè)的差異[16,19]。

表3 不同柳樹種質(zhì)的核DNA含量(1C值)

表4 不同類型柳樹核DNA含量的方差分析

基因組中重復(fù)序列的變化和多倍化事件是真核生物基因組進(jìn)化產(chǎn)生差異的主要原因。楊柳科植物起源于同一個(gè)古四倍體祖先，在逐步進(jìn)化過程中，重新二倍化后形成楊樹和柳樹2大進(jìn)化分支[20]。相比楊樹，柳樹進(jìn)化更加完全，由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性而導(dǎo)致基因組不斷的多倍化，形成了從二倍體(2n=38)到十二倍體(2n=228)的完整倍性體系[7]。有研究表明，同一類群中，物種的DNA C值與倍性水平呈正相關(guān)，即C值隨著倍性的增加而增大[21]。本研究中，通過表4方差分析可知，喬木和灌木2種類型間核DNA含量存在極顯著差異，且喬木類型要高于灌木類型。在自然界中，通常情況下灌木柳大多為二倍體，如簸箕柳、杞柳歐洲紅皮柳等，而喬木柳大多為多倍體，如垂柳、白柳、旱柳等，多為四倍體[7]。

在喬木類型中，鉆天柳屬于鉆天柳屬，而鉆天柳屬是介于楊屬和柳屬之間的過渡類型。據(jù)文獻(xiàn)記載，鉆天柳是二倍體[7]，因此其核DNA含量(0.48 pg)相比較其他喬木柳要小很多。而幾個(gè)喬木柳品種如蘇柳172、蘇柳932和蘇柳1011由不同喬木柳雜交而來，屬異源多倍體，其核DNA含量相比較其他喬木柳自然種要大很多。但幾個(gè)灌木柳品種如蘇柳2345、蘇柳52-2和蘇柳9-6在雜交后其核DNA含量相比其他灌木柳自然種差異不大。推測(cè)其原因，一方面可能是由于本研究中的待測(cè)樣本與雜交親本個(gè)體本身差異引起，另一方面可能是由于多倍體染色體組配對(duì)與重組更為復(fù)雜造成的[16]。此外，喬木類型中的粉枝柳(0.43 pg)和灌木類型中的灰柳(0.60 pg)在各自類型中與其他個(gè)體數(shù)值差異較大，推測(cè)可能是由于倍性差異而導(dǎo)致，有待于進(jìn)一步的核型分型來確認(rèn)。