四種石斛的薄層鑒別及多糖含量測(cè)定

張 婷 劉安韜 劉喜華 滕建北

1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系中藥教研室，廣西南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室，廣西南寧 530001

石斛藥材為蘭科植物金釵石斛Dendrobium nobile Lindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum Lindl.、流蘇石斛Dendrobium fimbriatum Hook.的栽培品及同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[1]。最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有益胃生津、滋陰清熱之功效。研究表明石斛含多糖、生物堿、酚類(lèi)等多種有效成分，其中石斛多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力功能[2]、防止機(jī)體氧化衰老、降低血糖血脂與抗炎等藥理作用，臨床上主要用于腫瘤、糖尿病、循環(huán)系統(tǒng)疾病等[3-17]，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。但石斛藥材來(lái)源復(fù)雜，性狀與顯微特征較為相似，為保證石斛用藥安全，本文對(duì)石斛的四種常用種類(lèi)美花石斛、金釵石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛進(jìn)行了薄層色譜鑒別研究，并建立了這四種石斛多糖含量測(cè)定方法，對(duì)比了四種石斛的多糖含量差異，為這四種石斛的質(zhì)量研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津儀器（蘇州）有限公司]；SQP 型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ-500DA 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SIM-F140AY65-PC 制冰機(jī)（日本，松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社）；Direct-Q5UV純水儀（默克密理博）；BSA224S 分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Medifuge 離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；H22-X3 紅外爐（杭州九陽(yáng)生活儀器有限公司）；DFY-500 打粉機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

50 mm×100 mm 硅膠G（青島海洋化工有限公司）；0.3 mm×100 mm 毛細(xì)管（上海長(zhǎng)城科學(xué)儀器商店經(jīng)銷(xiāo)）；GUZ3-J387 毛蘭素（中國(guó)食品藥品檢定研究 院，111874-201603）；LM76-PSS7 石 斛酚（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111875-201202）；LDOU-02FZ 石斛堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111876-201503）；碘（天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，CAS NO：7553-56-2）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

美花石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛原生藥材（采自廣西河池市宜州區(qū)），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室滕建北教授鑒定為蘭科石斛屬植物美花石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的莖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)四種石斛的多糖含量進(jìn)行均值、方差統(tǒng)計(jì)處理。顯著性檢驗(yàn)為F檢驗(yàn)，置信水平為95%。

2 薄層色譜鑒別

2.1 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取美花、金釵、鼓槌石斛三種藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）各1 g 和流蘇石斛粉末（過(guò)三號(hào)篩） 0.5 g，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部[1]薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密量取2 ml 甲醇溶液加入2 mg 石斛堿瓶中，配制成每1 ml 溶液里含1 mg 石斛堿作為對(duì)照品；精密量取2 ml 甲醇溶液加入0.4 mg 毛蘭素瓶中，配制成每1 ml 溶液里含0.2 mg 毛蘭素作為對(duì)照品；精密量取2 ml 甲醇溶液加入0.4 mg 石斛酚瓶中，配制成每1 ml 溶液里含0.2 mg 石斛酚作為對(duì)照品。

2.3 薄層色譜條件及薄層鑒別

將供試品及對(duì)照品溶液各10 μl 點(diǎn)于同一硅膠G 板，（60～90℃）石油醚-丙酮（7 ∶3）溫度28.6℃濕度50%～60%。展開(kāi)（展距約為8 cm），碘熏顯色。薄層色譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，四種石斛的斑點(diǎn)與石斛堿對(duì)照品斑點(diǎn)均相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明石斛堿在四種石斛中均存在；其中鼓槌石斛和流蘇石斛斑點(diǎn)顏色相對(duì)較淺，說(shuō)明其含的石斛堿含量較低；在毛蘭素斑點(diǎn)相應(yīng)位置中，其他三種石斛均沒(méi)有顯出斑點(diǎn)，僅鼓槌石斛在相應(yīng)位置有斑點(diǎn)，說(shuō)明毛蘭素成分在四種石斛中僅鼓槌石斛含有；與石斛酚斑點(diǎn)可對(duì)應(yīng)的有美花石斛、金釵石斛和鼓槌石斛，說(shuō)明石斛酚成分在此三種石斛中均含有。

3 四種石斛多糖含量測(cè)定

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

用分析天平精密稱(chēng)定0.009 g D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置100 ml 容量瓶中，加蒸餾水溶解至刻度線(xiàn)，配制成每1 ml 含90 μg（即0.09 mg/ml） 的對(duì)照品溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備

精確稱(chēng)取金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛粉末、美花石斛粉末（過(guò)三號(hào)篩）各0.3 g 各平分六份，置250 ml 錐形瓶中，加蒸餾水250 ml，加熱回流2 h 后，待冷卻后加純水補(bǔ)重。過(guò)濾，精密吸取2 ml 續(xù)濾液，置于刻度為15 ml 的離心管中，加入無(wú)水乙醇10 ml，搖勻后、冷藏1 h 后，離心（轉(zhuǎn)速為4000 r/min）20 min，沉淀再加8 ml 的80%乙醇洗滌2 次，離心10min，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml 量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得。

3.3 顯色測(cè)定方法

精密量取1 ml 的供試品溶液，依次放置于25 ml具塞試管中。精密加入5%苯酚溶液1 ml，充分搖勻。精密加入濃硫酸5 ml，置沸水中加熱20 min 后，立即放入冰浴中冷卻5 min。

另精密量取2 ml 蒸餾水，以相同方法，作為空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在485 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

3.4 波長(zhǎng)檢測(cè)

精密量取供試品溶液1 ml，以D-無(wú)水葡萄糖溶液作對(duì)照，在紫外-可見(jiàn)分光光度儀器全波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，蒸餾水作為空白。結(jié)果供試品與對(duì)照品最佳吸收波長(zhǎng)為485 nm，因此確定485 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 加入20 ml 具塞試管中，按照“3.3 項(xiàng)下”顯色。照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在485 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y），葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到線(xiàn)性回歸方程y=10.044x+0.0063，R=0.9994，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖的濃度在0.009～0.090 mg/ml 范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取1 ml 供試品溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，檢測(cè)方法同“3.5”項(xiàng)下，連續(xù)測(cè)定6 次，精密度試驗(yàn)的RSD 結(jié)果為0.52%，精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1 ml 供試品溶液，檢測(cè)方法同“3.5”項(xiàng)下，分別在0、10、20、30、40、50、60、90、120 min 時(shí)測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)定2 h。鼓槌石斛多糖RSD值為0.78%。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取鼓槌石斛粉末，過(guò)3 號(hào)篩，精密稱(chēng)定0.3 g，按“3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密量取1 ml，放入具塞試管中，按照“3.5”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果顯色RSD 值為2.07%。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)定D-無(wú)水葡萄糖0.83 mg，加入蒸餾水溶解，定容至25 ml 容量瓶。取6 支20 ml 具塞試管，精密量取葡萄糖對(duì)照品0.5 ml，再量取“3.2”項(xiàng)下的鼓槌石斛的供試品溶液0.5 ml，照“3.3”項(xiàng)顯色測(cè)定吸光度計(jì)算回收率，平均加樣回收率為100.40%，RSD 值為3.10%。

3.10 樣品的測(cè)定

分別精密稱(chēng)取四種石斛供試品溶液（每個(gè)樣品平行6 次），按“3.5”項(xiàng)下進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算多糖含量（表1）。

由表1 可知，美花石斛多糖含量高于其他三種石斛，鼓槌石斛多糖含量低于其余三種；四種石斛的多糖含量由大到小依次為美花石斛＞金釵石斛＞流蘇石斛＞鼓槌石斛（24.02%＞13.48%＞8.55%＞6.55%）。

表1 四種石斛的多糖含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

四種石斛多糖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明四種石斛的多糖含量差異都極顯著。

4 討論

薄層色譜（TLC）也叫薄層層析，因分離是在一平面薄層上進(jìn)行而得名。因其快速、簡(jiǎn)便和微量的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，薄層色譜的基本原理是利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同，使在流動(dòng)相（溶劑）流過(guò)固定相（吸附劑）的過(guò)程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分的互相分離的目的。薄層色譜法是目前中藥材鑒別常用的鑒別方法，具有操作簡(jiǎn)便、直觀(guān)、分辨力高、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）[1]中被廣泛采用[10-11]。

鑒于石斛種類(lèi)較多[9]，性狀與顯微特征較為相似，難以正確鑒別石斛藥材，因而本研究采用薄層鑒別法對(duì)四種石斛進(jìn)行鑒別研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛蘭素可作為鼓槌石斛的鑒別成分，填補(bǔ)了目前石斛的薄層鑒別研究[18-19]的空白，且專(zhuān)屬性良好。

中藥中的多糖類(lèi)成分具有豐富的藥理活性，如豬苓多糖、香菇多糖等有抗腫瘤的作用，人參多糖有增強(qiáng)免疫的作用[20]，石斛多糖具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力[20-21]、抗腫瘤[22]等作用，多糖一般由D-葡萄糖，D-阿拉伯糖和D-半乳糖等聚合而成，因其在強(qiáng)酸中反應(yīng)成醛，進(jìn)一步與酚類(lèi)縮合產(chǎn)生特有的有色物質(zhì)，因此硫酸蒽酮法和鹽酸苯酚法可以用來(lái)測(cè)定多糖的含量，研究表明硫酸苯酚法較為穩(wěn)定，作為多糖含量測(cè)定的方法更為理想[20]。本實(shí)驗(yàn)選取石斛鮮莖，采用鹽酸苯酚法進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，采用合理的定容方式，準(zhǔn)確測(cè)定了金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的多糖濃度，為石斛質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。