p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染檢測在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值

陳小燕，韓春艷，王紅霞

深圳市南山區(qū)婦幼保健院婦女保健科，廣東深圳518000

宮頸癌的癌前病變持續(xù)時間較長，早期篩查可及時發(fā)現(xiàn)癌前病變和早期浸潤癌，從而達(dá)到預(yù)防和減少宮頸癌發(fā)生的目的[1]。目前，常用的宮頸癌初篩手段包括液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢測和高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)篩查等[2-3]。對于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查提示的未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)和低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)，可采用HR-HPV篩查進(jìn)行分流，但仍有高級別子宮頸病變漏診的情況發(fā)生[4]。

p16是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，目前已被證實其在HR-HPV感染中高度表達(dá)，被認(rèn)為是宮頸癌前病變的替代標(biāo)志物[5]。Ki-67是一種核抗原和細(xì)胞增殖標(biāo)志物，在除G0外的所有細(xì)胞周期中表達(dá)。正常細(xì)胞中，p16和Ki-67的表達(dá)是互斥的，同時檢測細(xì)胞中p16、Ki-67的表達(dá)可提早預(yù)測細(xì)胞周期失調(diào)以及可能癌變的HR-HPV感染[6]。本研究對行宮頸癌篩查的400例患者進(jìn)行p16/Ki-67雙染色檢測，通過與其他檢查手段比較，旨在探討p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染檢測在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年1～12月在深圳市南山區(qū)婦幼保健院進(jìn)行宮頸癌篩查的400例社區(qū)居民作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均在我院順利完成高危型HPV(HR-HPV)篩查、液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢測和p16/Ki-67雙染色檢測；(2)組織病理學(xué)結(jié)果明確；(3)均有性生活史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有宮頸癌或?qū)m頸局部不明腫瘤史者；(2)具有宮頸局部切除史或放療、化療治療史者；(3)手術(shù)子宮切除者，剩余液基細(xì)胞不符合樣本制作要求者；(4)合并自身免疫性疾病或口服免疫抑制劑者。體檢婦女年齡22～63歲，平均(42.28±5.52)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受檢者均知情并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 HR-HPV篩查所有受檢者采集液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢測標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測，采用特質(zhì)毛刷從宮頸中順時針旋轉(zhuǎn)5圈后裝入Digene樣本保存液中保存，未絕經(jīng)者于月經(jīng)中期取樣，檢查前3 d未進(jìn)行陰道沖洗，并禁止性生活。采集的TCT檢測標(biāo)本中取1 mL，采用Cobas HPV檢測法(美國Roche Molecular Systems公司)進(jìn)行HR-HPV檢測和基因分型，Cobas HPV檢測采用自動制樣和實時PCR技術(shù)對14種HR-HPV基因型進(jìn)行檢測，包括HPV-16、HPV-18以及其他12種亞型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。

1.2.2 TCT檢測采用Thinprep 2000系統(tǒng)(美國Hologic公司)制備薄層細(xì)胞涂片，將細(xì)胞學(xué)涂片固定于95%乙醇溶液中30 min后進(jìn)行巴氏染色，由兩名婦科細(xì)胞病理學(xué)專業(yè)醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行閱片，細(xì)胞學(xué)結(jié)果分為[7]：(1)良性反應(yīng)性細(xì)胞改變(NILM)；(2)意義不明確的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)；(3)低級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)；(4)高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)；(5)宮頸鱗狀細(xì)胞癌(SCC)；(6)意義不明確的非典型腺細(xì)胞(AGUS)和腺癌(ACC)。

1.2.3 p16/Ki-67雙染色檢測采用羅氏公司的Ventana Benchmark XT型全自動免疫組織化學(xué)染色儀對所有患者的TCT檢測樣本進(jìn)行p16、Ki-67染色，試劑盒購自羅氏公司抗p16(E6H4)/Ki-67(274-11AC3)單克隆抗體試劑。取TCT檢測樣本進(jìn)行常規(guī)制片、乙醇固定后晾干備用，一抗孵育，過氧化物酶多聚體結(jié)合，染色結(jié)束后去除切片，洗凈后自然晾干、封固并進(jìn)行觀察。P16信號表達(dá)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上，顯紅色；Ki-67信號表達(dá)在細(xì)胞核上，顯棕黃色。兩者均染色交叉部分細(xì)胞核呈棕褐色，為陽性；單獨顯色或不顯色為陰性(圖1)。

圖1 p16/Ki-67雙染色檢測結(jié)果(×200)

1.2.4 組織病理學(xué)在陰道鏡檢查術(shù)中取受檢者宮頸活組織標(biāo)本，對其進(jìn)行固定、常規(guī)脫水、包埋和切片操作后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。由兩名病理資深醫(yī)師進(jìn)行獨立閱片，根據(jù)上皮病變及宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，將CIN2、CIN3、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌歸為CIN2及以上病變(CIN2+)，其余為CIN2以下病變(CIN2-)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率(%)形式表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢查方式檢出CIN2+病變的診斷效能p16/Ki-67雙染色在檢出CIN2+病變上的敏感度、陰性預(yù)測值均明顯高于TCT檢測，特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均明顯高于HR-HPV篩查，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 p16/Ki-67雙 染 色、HR-HPV篩 查 檢 出ASC-US、LSIL的敏感度、特異度比較p16/Ki-67雙染色檢出ASC-US、LSIL的敏感度明顯高于HR-HPV篩查，而檢出ASC-US的特異度明顯低于HR-HPV篩查，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表1 不同檢查方式檢出CIN2+病變的診斷效能比較(%)

表2 p16/Ki-67雙染色、HR-HPV篩查檢出ASC-US、LSIL的敏感度、特異度比較(%)

2.3 不同檢查方式檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者的診斷效能p16/Ki-67雙染色檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者的敏感度、陰性預(yù)測值明顯高于TCT檢測和HPV16/18檢測，其特異度明顯低于HPV16/18檢測，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同檢查方式檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者的診斷效能比較(%)

3 討論

宮頸癌的癌變過程是一個長時間、連續(xù)發(fā)展的過程，初始階段通常無特殊癥狀[8]。及早發(fā)現(xiàn)、治療宮頸癌前病變是預(yù)防宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要手段。目前，宮頸癌篩查以TCT和HR-HPV檢測為主。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，TCT檢測存在假陰性率偏高，質(zhì)量控制不佳等問題[9]。TCT檢測結(jié)果中的ASC-US和LSIL，病理結(jié)果提示異常的鱗狀上皮細(xì)胞已超過反應(yīng)性改變，但嚴(yán)重程度上又不足以診斷為CIN2+，5年內(nèi)仍有轉(zhuǎn)變?yōu)镃IN2+的風(fēng)險[10-11]。對于該類患者，臨床上采用定期隨訪、HR-HPV檢測分流或陰道鏡活檢進(jìn)行處理。與TCT檢測相比，HR-HPV檢測具有更高的敏感度和客觀性，但其特異度較低；反復(fù)定期隨訪容易使患者產(chǎn)生不必要的緊張情緒和過度的跟蹤隨訪；陰道鏡則屬于有創(chuàng)檢查。因此，尋找一種方便快捷、特異度較高的檢測手段用于宮頸癌篩查極為必要[12]。

p16是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白，能夠直接抑制細(xì)胞周期紊亂，介導(dǎo)細(xì)胞的無限制增生，被用于多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的評估中[13]。Ki-67是增殖性細(xì)胞核抗原，僅在G0期表達(dá)缺失，也被用于多種惡性腫瘤的預(yù)后評估[14]。在生理機(jī)能正常的細(xì)胞中，p16、Ki-67相互拮抗，若兩者在同一細(xì)胞中均有表達(dá)，代表細(xì)胞周期失調(diào)，預(yù)示著高級別病變的可能[15]。p16/Ki-67雙染色能夠幫助檢出真正的病變細(xì)胞，且不依賴于形態(tài)學(xué)檢測。

本研究以病理學(xué)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對p16/Ki-67雙染色檢測結(jié)果的可靠性和在宮頸癌篩查中的應(yīng)用可行性進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，p16/Ki-67雙染色在檢出CIN2+病變上的敏感度、陰性預(yù)測值(分別為70.00%、82.76%)高于TCT檢測(分別為70.00%、82.76%)，p16/Ki-67雙染色在檢出CIN2+病變上的特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為43.33%、34.87%和93.53%，均明顯高于HR-HPV篩查(分別為7.00%、25.60%、84.00%)。p16/Ki-67雙染色在檢出宮頸高級別上皮內(nèi)病變的敏感度高于TCT檢測，與HR-HPV篩查接近，但其特異性明顯高于HR-HPV篩查。

另外，在檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者上，p16/Ki-67雙染色的敏感度、陰性預(yù)測值(分別為91.67%、93.75%)均明顯高于TCT檢測(分別為69.79%、82.74%)和HPV16/18檢測(分別為48.96%、79.50%)，其特異度(42.86%)明顯低于HPV16/18檢測(67.86%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果表明，在HR-HPV患者的篩查管理中，p16/Ki-67雙染色與細(xì)胞學(xué)篩查相比可提高靈敏度和特異性[16]，減少誤診、漏診等情況發(fā)生。

在診斷ASC-US、LSIL上，p16/Ki-67雙染色的敏感度分別為59.62%、48.39%，均明顯高于HR-HPV篩查(分別為11.54%、10.75%)，p16/Ki-67雙染色在檢出ASC-US的特異度(66.09%)明顯低于HR-HPV篩查(93.97%)。上述結(jié)果提示，p16/Ki-67雙染色在診斷ASC-US、LSIL的敏感度高于HR-HPV篩查，將p16/Ki-67雙染色用于宮頸高級別病變的鑒別診斷中，能夠使分流至陰道鏡檢查、宮頸活檢等創(chuàng)傷性檢查的患者大大減少，可避免過度診斷和治療[17]。

綜上所述，p16、Ki-67是宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)標(biāo)志物指標(biāo)，p16/Ki-67雙染色在鑒別診斷高級別宮頸上皮病變上具有較高的診斷準(zhǔn)確率，能夠較為準(zhǔn)確地對ASC-US、LSIL患者進(jìn)行分流，值得在臨床上推廣應(yīng)用。