人工合成肽GH12在齲病防治中的研究進(jìn)展

王丹妮綜述趙月萍審校

暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510000

瑞典科學(xué)家BOMAN等在1972年發(fā)現(xiàn)的一種抑制細(xì)菌增殖的肽，這種肽在1981年被正式命名為抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)?？咕氖且活惗痰膸д姾傻纳锘钚苑肿?，廣泛分布于人類的唾液、上皮和中性粒細(xì)胞中，具有廣泛的抗菌活性。迄今為止，有許多學(xué)者已經(jīng)研究了許多天然抗菌肽對(duì)齲病的致齲細(xì)菌的作用，包括α防御素、β防御素、凱薩林菌素和人乳鐵蛋白等[1-2]。但由于天然抗菌肽存在毒性、溶血性、成本高、不易獲得等缺點(diǎn)，近年來(lái)研究者們開始設(shè)計(jì)合成肽，它們比現(xiàn)有的AMPs更短，細(xì)胞毒性更小，對(duì)致齲細(xì)菌更有效。

1 齲病病因及防治現(xiàn)狀

齲病是一種牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的口腔疾病，而細(xì)菌是公認(rèn)的齲病病因之一，其所形成的牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生的始動(dòng)因子。盡管取得了顯著的進(jìn)步技術(shù)和口腔保健意識(shí)的提高，齲齒患病率仍在快速地增長(zhǎng)[3]?？谇痪簭?fù)雜，但研究表明[4-5]，在早期生物膜群落中超過60%是鏈球菌，且鏈球菌中的變形鏈球菌是目前公認(rèn)的主要的致齲菌和病原體。對(duì)于早期釉質(zhì)齲損，治療方案通常是藥物治療和充填治療，氟化物通常被添加到水和牙膏中來(lái)防齲和阻止早期齲損的進(jìn)一步發(fā)展。氟化物通過抑制脫礦和增強(qiáng)晶體表面的再礦化來(lái)防齲，對(duì)于合適使用濃度方面仍然有爭(zhēng)議，使用較高氟化物的濃度可導(dǎo)致一定的毒副作用，比如氟斑牙、氟骨癥[6-8]。氯己定是一種陽(yáng)離子廣譜抑菌劑，能有效抑制變形鏈球菌的數(shù)量及活性[9-10]，通常被制成漱口水使用來(lái)防治齲病，但是有使牙齒、黏膜著色、齦上結(jié)石形成增加、味覺暫時(shí)喪失等副作用。而對(duì)于形成齲洞的主要是通過充填治療，去除腐質(zhì)后進(jìn)行完善的充填可以很好的緩解齲病，如若腐質(zhì)未去盡造成的細(xì)菌殘留可引起繼發(fā)齲壞，造成治療的失敗。目前，抑制致齲性口腔鏈球菌的生長(zhǎng)仍有望在有限的時(shí)間內(nèi)用作齲齒控制的輔助療法，特別是對(duì)高齲齒風(fēng)險(xiǎn)或齲齒活躍的個(gè)體。

2 抗菌肽的分類及與合成抗菌肽GH12

天然抗菌肽具有多效功能，它們不僅殺微生滅物，還參與調(diào)控宿主的生理功能，比如參與炎癥反應(yīng)、傷口愈合等。它們的活性包括有趨化功能、細(xì)胞因子產(chǎn)生、組胺釋放、脂多糖結(jié)合和其他免疫調(diào)節(jié)活性，這些活性共同導(dǎo)致適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活[11]?？咕陌凑諄?lái)源分類可分為昆蟲來(lái)源肽、兩棲動(dòng)物來(lái)源肽、哺乳動(dòng)物來(lái)源肽、植物來(lái)源肽、細(xì)菌來(lái)源肽。按照結(jié)構(gòu)分類主要分包括α螺旋、β折疊、環(huán)形和伸展性結(jié)構(gòu)四類[12]。與口腔疾病關(guān)系密切的幾種抗菌肽主要有防御素、凱瑟林菌素及富組蛋白。

2.1 防御素最早在人類中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是從參與宿主防御的肥大細(xì)胞和組織中分離出來(lái)的1 845個(gè)氨基酸長(zhǎng)的陽(yáng)離子分子。人防御素被分類為α-防御素(HNP)、β-防御素(HBD)。α-防御素被進(jìn)一步細(xì)分為六種類型，其中HNP-1抗菌活性最強(qiáng)，對(duì)變異鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌有抗菌活性，尤其是變異鏈球菌對(duì)HNP-1最為敏感。β-防御素主要在各種組織和器官，比如牙齦、皮膚、胃腸道、呼吸道及腎臟的上皮細(xì)胞中表達(dá)。HBD-2與HBD-3均能殺滅包括變異鏈球菌在內(nèi)的多種口腔鏈球菌，且HBD-3對(duì)致齲菌的抗菌效果最強(qiáng)[13]。

2.2 凱瑟林菌素(Cathelicidins)最初是從豬白細(xì)胞中分離出來(lái)的，它們是具有高度保守的N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端抗菌結(jié)構(gòu)域的前體蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，表現(xiàn)出廣泛的抗菌活性[14-15]。

2.3 富組蛋白(Histatins)由健康成人的腮腺和下頜下腺唾液管細(xì)胞合成，三個(gè)主要成員是His-1，His-3和His-5。它能夠抑制口腔念珠菌的生長(zhǎng)，參與唾液中金屬離子的鍵合，口腔止血的調(diào)節(jié)、參與牙釉質(zhì)膜的形成[13]。

2.4 合成抗菌肽GH12使用天然產(chǎn)生的抗菌肽作為治療劑有一些需要克服的局限性[16]，它們可能存在毒性、免疫原性、耐藥性、溶血活性和其他副作用[17-18]。為了獲得更強(qiáng)的生物效應(yīng)并克服天然肽的缺點(diǎn)，人工合成肽是通過將兩種或更多種具有不同生物功能的不同肽的序列進(jìn)行組合而設(shè)計(jì)，通過人為的控制其特性可以更廣泛的在口腔疾病方面應(yīng)用[19]。有學(xué)者設(shè)計(jì)合成了只含有12個(gè)氨基酸的具有兩親性的α-螺旋抗菌肽GH12(GLLWLHLHLLH-NH2)[20]，在GH12序列的疏水側(cè)起點(diǎn)和親水側(cè)終點(diǎn)之間的界面處放置了一個(gè)色氨酸殘基，這種設(shè)計(jì)能夠穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)并提高抗微生物活性[21]，由于其穩(wěn)定性更好、生產(chǎn)成本更低，未來(lái)可能廣泛用于齲病治療。

3 人工合成肽GH12對(duì)主要致齲菌的殺滅效果

3.1 體外研究效果TU等[20]首次對(duì)GH12對(duì)口腔鏈球菌的抗菌和作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)GH12能有效抑制口腔鏈球菌，尤其對(duì)變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌和唾液鏈球菌的抑制效果更為明顯。GH12對(duì)口腔鏈球菌的MIC值為6.7～32.0μg/mL，MBC值為8.0～64.0μg/mL。GH12同其他α-螺旋抗菌肽一樣，在到達(dá)細(xì)胞膜后，分子的親水面被帶負(fù)電荷的磷脂頭基團(tuán)吸引，而疏水面插入雙層[22]，在膜表面產(chǎn)生孔和破裂。盡管GH12具有上述防齲潛力，但它們對(duì)牙菌斑和齲齒的作用機(jī)制仍有待闡明。由于其大多數(shù)抗微生物研究數(shù)據(jù)是在口腔鏈球菌的浮游培養(yǎng)物中進(jìn)行的，而關(guān)于它們的生物膜對(duì)應(yīng)物的可用數(shù)據(jù)有限[23]。研究表明，與浮游狀態(tài)的細(xì)菌相比，生物膜與齲病的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)[24]。絕大多數(shù)研究表明，以浮游菌為基礎(chǔ)的藥物研究結(jié)果并不適用于生物膜內(nèi)的細(xì)菌[25-26]。WANG等[27]從3種短抗菌肽中篩選出了二級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定、抗菌活性最強(qiáng)的肽GH12，研究了其對(duì)八種主要浮游致齲細(xì)菌的抗菌活性，并研究了其對(duì)單一變異鏈球菌生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)GH12在低濃度下通過抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)來(lái)抑制變異鏈球菌生物膜的形成。隨后JIANG等[28]研究了GH12對(duì)致齲多菌種(變異鏈球菌、血鏈球菌和戈登鏈球菌)生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的GH12對(duì)生物膜中三種菌種的比例隨時(shí)間變化也有一定的影響，4 mg/L和8 mg/L的GH12對(duì)變形鏈球菌有明顯的抑制作用，但對(duì)血鏈球菌和戈登鏈球菌卻基本沒有影響。有學(xué)者指出，一種生物的代謝產(chǎn)物很可能對(duì)同一生物膜中種群間產(chǎn)生影響，而GH12通過降低生物膜中變形鏈球菌的胞外多糖的合成和乳酸生產(chǎn)及促進(jìn)血鏈球菌和戈登氏球菌中過氧化氫的產(chǎn)生兩部分機(jī)制來(lái)改變多菌種生物膜的組成[29]。GH12顯著上調(diào)過氧化氫產(chǎn)生相關(guān)的表達(dá)基因spxB，促進(jìn)血鏈球菌和戈登氏球菌中過氧化氫的產(chǎn)生，提高它們的生態(tài)優(yōu)勢(shì)。但該研究并未對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸相關(guān)的毒力因子進(jìn)行探究，而變異鏈球菌產(chǎn)酸、耐酸、合成外多糖和形成生物膜的能力主要跟變異鏈球菌的毒力因子有關(guān)[30-31]，并且變異鏈球菌的致齲潛能不是由幾個(gè)毒力基因獨(dú)立表達(dá)的結(jié)果，而是一系列協(xié)同調(diào)節(jié)事件的結(jié)果[32]。隨后WANG等[33]第一次系統(tǒng)地研究AMPs對(duì)變異鏈球菌毒力和調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響，以亞MIC水平測(cè)定了GH12處理的變異鏈球菌的各種毒力基因(ldh、atpD、gtfB、gtfC、gtfD)和TCSTS基因(vicR、DAiR、comD、comE)的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)被亞MIC水平GH12處理的變異鏈球菌的各種毒力基因幾乎均顯著下調(diào)，滅活特定調(diào)節(jié)系統(tǒng)，乳酸生成和乳酸脫氫酶(LDH)活性降低，導(dǎo)致產(chǎn)酸性、耐酸能力降低，胞外多糖合成減少和生物膜形成能力降低[33]。盡管如此，這些研究都是基于體外的研究。

3.2 體內(nèi)研究效果為了進(jìn)一步了解體內(nèi)的防齲效果，WANG等[34]采用了大鼠模型來(lái)測(cè)試局部應(yīng)用GH12是否能抑制體內(nèi)齲齒的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，其結(jié)果表明GH12可降低大鼠不同嚴(yán)重程度的齲病發(fā)生率和相應(yīng)的變形鏈球菌種群，且局部使用8 mg/L GH12的效果明顯優(yōu)于250 ppm氟化物。由于GH12對(duì)變異鏈球菌生物膜的生物量和致齲特性的聯(lián)合抑制作用，使體內(nèi)變異鏈球菌的種群數(shù)量減少，殘留的變異鏈球菌生物膜酸性較弱且致密，從而抑制了齲的發(fā)生和發(fā)展。AMPs在體外和體內(nèi)對(duì)復(fù)雜多種生物膜的功效仍有待進(jìn)一步研究，盡管研究者用了牙菌斑衍生的多種生物膜和大鼠齲齒模型來(lái)模擬牙菌斑和實(shí)際治療應(yīng)用，但它不能完全代表的影響人類口腔中的實(shí)際環(huán)境，因此應(yīng)該進(jìn)行進(jìn)一步的研究。為了模擬更為復(fù)雜、真實(shí)的口腔生物膜環(huán)境，JIANG等[35]選取了健康人體牙菌斑生物膜來(lái)研究，與之前實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有所不同，之前的研究表明8 mg/L的GH12能夠抑制預(yù)制的變異鏈球菌生物膜。然而在這項(xiàng)研究中，8 mg/L的GH12對(duì)牙菌斑來(lái)源的多種生物不足以顯示出抑制作用，而需要64 mg/L才顯示出最有效的抑制作用。這可能由于牙菌斑對(duì)抗菌劑具有更強(qiáng)的耐藥性，這也說(shuō)明了單獨(dú)使用變異鏈球菌生物膜模型可能還不足以說(shuō)明GH12的體外防齲效果。

4 展望

GH12作為一種人工合成的短肽具有良好的抗菌活性，未來(lái)可能成為抗生素及氟化物的替代產(chǎn)品，被制成漱口水或者牙膏制劑用于齲病的防治。目前的研究大多還處于體外階段，為了更深入的了解可能還需要模擬更真實(shí)的口腔微生物環(huán)境和更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。在口腔內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下對(duì)菌斑生物膜的殺滅效果未來(lái)仍需要大量的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)探討。而且作為漱口水及牙膏添加劑，使用頻率高、在口腔內(nèi)停留時(shí)間短，要在這么短的停留時(shí)間達(dá)到預(yù)期效果還需尋找出更為精確的合適使用濃度，既要能發(fā)揮最好的療效，長(zhǎng)期使用又不至于造成口腔內(nèi)微生物菌群的失調(diào)和微生態(tài)的失衡。