早產(chǎn)兒出生后4周內(nèi)腸道微生物的產(chǎn)氣差異

王雪芳李娟朱立穎尹迪張華婷李娜龔小慧胡勇△

（1上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院新生兒科上海200062；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所-農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危險因子和風(fēng)險防控國家重點(diǎn)實驗室（籌）杭州310021）

嬰兒胃腸道的微生物定植是人類生命周期中的一個重要過程，因為微生物群和宿主建立的相互作用對人類健康和疾病具有重要影響。傳統(tǒng)上，人們認(rèn)為出生時腸道是無菌的［1］，很快被來自母體和周圍環(huán)境的微生物定植，此理論依據(jù)是不能從羊水或嬰兒的皮膚表面培養(yǎng)細(xì)菌。然而，隨著16SRNA測序技術(shù)的出現(xiàn)，一些研究表明，健康宿主的胎糞實際上不是無菌的，腸道定植開始于出生前［2-4］，4～6個月時達(dá)到成年人的水平，1歲以后腸道菌群的種類趨于穩(wěn)定。與足月兒相比，早產(chǎn)兒的腸道細(xì)菌定植模式被描述為延遲和異常［5］。在生命的最初幾周，異常的腸道定植可能改變宿主微生物群的屏障、營養(yǎng)和免疫功能，從而增加對疾病的易感性［6-7］。其中，腹脹為新生兒期常見癥狀之一，也是危重患兒病情惡化的征兆，尤其多見于早產(chǎn)兒。新生兒腹脹以氣腹多見，如新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、乳糖不耐受等疾病相關(guān)臨床表現(xiàn)與氣體的大量產(chǎn)生密切相關(guān)。已被證實，腸道內(nèi)大部分氣體不是由人類宿主產(chǎn)生的，而是腸道微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物［8］，這些氣體包括二氧化碳、氫氣、甲烷和硫化氫［9］。目前已有研究者報道成年人腸道氣體經(jīng)肛門的排泄率為1.48 mL/min，經(jīng)肛門所排出氣體的主要組分為氮?dú)猓?9%），氫氣（20.9%），二氧化碳（9%），甲烷（7.2%），氧氣（3.9%）和硫化氫（0.000 28%）［10-11］，而新生兒腸道微生物的產(chǎn)氣量及各種氣體所占的比例暫未見報道。

目前腸道發(fā)酵氣體常用的檢測設(shè)備是呼吸氣體測定儀，其檢測到的氣體組成及所占比例更接近于胃內(nèi)氣體的組成成分，該儀器主要用于診斷小腸部分細(xì)菌的過度生長和過度發(fā)酵［12-13］。而對結(jié)腸部位細(xì)菌活性產(chǎn)生氣體的檢測目前除了檢測屁的組成成分［11］，沒有可靠的方案和設(shè)備，特別是對新生兒這類無法應(yīng)用呼吸氣體測定儀、不便收集經(jīng)肛門排出的氣體的研究對象。本實驗所應(yīng)用的國內(nèi)首創(chuàng)的體外發(fā)酵模型與氣體分析儀，是直接將受試者的糞便懸液接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行體外發(fā)酵，從而檢測氣體成分，更能準(zhǔn)確地檢測出受試者結(jié)腸部位微生物所產(chǎn)氣體的含量、組成成分及各成分所占比例。與呼吸氣體測定儀相比，本技術(shù)可適用人群較廣，且所測氣體的相關(guān)數(shù)值更接近于結(jié)腸部位的氣體產(chǎn)量及組成成分。相對于屁的成分的檢測，本技術(shù)所產(chǎn)生的誤差較小，且更方便進(jìn)行。

本文納入處于新生兒期的早產(chǎn)兒，研究其出生后不同日齡時腸道微生物的產(chǎn)氣量及二氧化碳、氫氣、甲烷、硫化氫所占比例，希望對新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、乳糖不耐受等疾病的病理機(jī)制研究提供新的思路和方法。

資料和方法

納入/排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：出生時胎齡≥28周且＜37周，并獲得父母書面知情同意；排除標(biāo)準(zhǔn)：有畸形或代謝性疾病，或未獲得父母書面知情同意。

一般資料招募2020年5月1日—6月1日期間生后即入上海市兒童醫(yī)院治療的19名早產(chǎn)兒，被納入研究的早產(chǎn)兒均符合上述標(biāo)準(zhǔn)，另外納入12組不接種糞便的空白培養(yǎng)基作為對照。納入研究的早產(chǎn)兒的平均胎齡為31周（28+1周～36+3周），平均體重為1 385.5 g（850～2 040 g），其中男嬰12人、女嬰7人；10名是順產(chǎn)出生，9名是剖宮產(chǎn)出生（表1）。

表1 19名早產(chǎn)兒的出生情況Tab 1 Thebirth of 19 preterm infants

糞便樣本收集及處理在受試者出生的1個月內(nèi)，采用常規(guī)糞便取樣盒分別在其生后3天內(nèi)、1周、2周、3周、4周時刮取尿不濕表面新鮮糞便，用厭氧磷酸緩沖液（PBS）配制成質(zhì)量濃度為100 g/L的糞便懸液，混勻后用0.125 mm的無菌金屬篩過濾除去大的食物殘渣，接種0.5 mL糞便懸液進(jìn)入15 mL密封培養(yǎng)基中。實驗所采用的4種培養(yǎng)基為：培養(yǎng)基LAT（以乳糖為主要碳源）、培養(yǎng)基FOS（以低聚果糖為主要碳源）、培養(yǎng)基FL-2（以母乳低聚糖中的2’-巖藻糖基乳糖為主要碳源）和培養(yǎng)基GOS（以低聚半乳糖為主要碳源）。培養(yǎng)基其他共有組分包括：胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物2.5 g/L；L-半胱氨酸1 g/L；血 紅 素2 mL/L；NaCl 0.9 g/L；CaCl2·6H2O 0.09 g/L；KH2PO40.45g/L；K2HPO40.45 g/L；MgSO4·7H2O 0.09 g/L；維生素I 200μL/L；刃天青（1 g/L）1 mL。維生素I溶液包括：生物素0.05 g/L，鈷胺素0.05 g/L，對氨基苯甲酸0.15 g/L，葉酸0.25 g/L，吡哆胺0.75 g/L。

體外發(fā)酵本研究采用批量發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行［14］。將500μL處理好的新鮮糞便接種液接種到培養(yǎng)基中，然后放置到37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

氣體測量基于體外模擬平臺，批量液體培養(yǎng)腸道菌群，使其產(chǎn)生氣體，而后用腸道微生物發(fā)酵氣體分析儀檢測其產(chǎn)氣總量與二氧化碳、氫氣、甲烷和硫化氫所占比例。

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對各組間產(chǎn)氣量、各種氣體所占比例進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位間距）即M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

24小時產(chǎn)氣總量如圖1和表2所示，隨著日齡的增加，各培養(yǎng)基組總產(chǎn)氣量呈遞增趨勢，間接證明隨著早產(chǎn)兒日齡增加，腸道菌群的數(shù)量及多樣性增加。早產(chǎn)兒相同日齡下，培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2、GOS組間相比，培養(yǎng)基LAT組的產(chǎn)氣總量最大，培養(yǎng)基FL-2組產(chǎn)氣量最小。

表2 早產(chǎn)兒不同日齡下各培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)氣總量分布表Tab 2 Distribution of total gas production in different media of preterm infants at different ages ［mL，M（P25，P75）］

圖1 各組產(chǎn)氣總量差異圖Fig 1 Difference of total gas production among four media

二氧化碳所占比例如圖2和表3所示，在4種培養(yǎng)基中，早產(chǎn)兒出生后第2周時開始產(chǎn)生數(shù)量較多的二氧化碳，早產(chǎn)兒相同日齡下，培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2、GOS組間相比，培養(yǎng)基FL-2組產(chǎn)二氧化碳量最小。

圖2 各組二氧化碳所占比例差異圖Fig 2 The proportion difference of carbon dioxide among four media

表3 早產(chǎn)兒不同日齡下各培養(yǎng)基內(nèi)二氧化碳所占比例分布表Tab 3 Distribution of carbon dioxide in different media of preterm infants at different ages ［%，M（P25，P75）］

甲烷所占比例如圖3和表4所示，在4種培養(yǎng)基中，空白對照組與早產(chǎn)兒出生后3天內(nèi)、1周、2周、3周、4周時均檢測到了甲烷，培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2中檢測到甲烷的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，培養(yǎng)基GOS中檢測到甲烷的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

氫氣所占比例如圖4和表5所示，在培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2、GOS中，均發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒出生后第2周開始產(chǎn)生數(shù)量較多的氫氣。無論早產(chǎn)兒處于何種日齡，培養(yǎng)基LAT中產(chǎn)H2的量均最多，培養(yǎng)基FL-2中產(chǎn)氫氣的量均最少。

硫化氫所占比例如圖5和表6所示，在培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2、GOS中，均發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒出生后第2周方才產(chǎn)生一定數(shù)量的硫化氫。無論早產(chǎn)兒處于何種日齡，培養(yǎng)基FL-2中產(chǎn)H2S的量均最少。

4種氣體所占比例的對比如圖6所示，早產(chǎn)兒出生后腸道微生物即可產(chǎn)生甲烷，但是，隨著早產(chǎn)兒日齡的增加，甲烷所占比例無明顯變化。早產(chǎn)兒出生后第2周，方才檢測出數(shù)量較多的二氧化碳、氫氣、硫化氫。早產(chǎn)兒出生后第2～4周時，這4種氣體所占比例的遞減排序均為：二氧化碳、氫氣、甲烷、硫化氫。

表4 早產(chǎn)兒不同日齡下各培養(yǎng)基內(nèi)甲烷所占比例分布表Tab 4 Distribution of methane in different media of preterm infants at different ages［%，M（P25，P75）］

圖3 各組甲烷所占比例差異圖Fig 3 The proportion difference of methane in each medium

圖4 各組氫氣所占比例差異圖Fig 4 The proportion difference of hydrogen in each medium

討 論

既往研究通過檢測呼出氣體的成分，認(rèn)為兒童3歲以前從未檢測到甲烷，隨著年齡增長，甲烷的產(chǎn)生也在增加，3歲和4歲兒童平均值為6.4%，直到10歲時達(dá)到成年分布［15-16］。然而，呼吸中不排出CH4的患者實際上可以在結(jié)腸氣體中存在甲烷［17］，Rutili等［18］在一名27個月的受試者中檢出了產(chǎn)甲烷菌。Dridi等［19］通 過 改 進(jìn) 的DNA檢 測 證 實 了 產(chǎn) 甲 烷 菌M.smithii和M.stadtmanae在人類腸道中的高流行率，前者幾乎是腸道微生物群落中普遍存在的寄居者，其實驗的受試者年齡最小為1個月。

本研究利用體外發(fā)酵模擬平臺及氣體檢測儀檢測早產(chǎn)兒出生后4周內(nèi)腸道微生物的產(chǎn)氣情況，結(jié)果顯示：空白對照組與早產(chǎn)兒出生后3天內(nèi)、1周、2周、3周、4周時均檢測到甲烷的產(chǎn)生。然而，培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2中各組檢測到的甲烷的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，培養(yǎng)基GOS中各組檢測到的甲烷的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可引出兩種假設(shè)：（1）早產(chǎn)兒出生后4周內(nèi)腸道微生物也許即可經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生甲烷；（2）我們所檢測到的甲烷也許是培養(yǎng)基或是氣體分析儀的數(shù)據(jù)基線。為進(jìn)一步排除培養(yǎng)基和氣體分析儀的問題，我們重新調(diào)試儀器，重新檢測了空白對照組，所測氣體數(shù)據(jù)均為0。但因本實驗所收集的標(biāo)本已失效，無法再次進(jìn)行氣體的檢測，我們重新留取了早產(chǎn)兒出生后4周內(nèi)的糞便進(jìn)行體外發(fā)酵和氣體檢測，仍可檢測到甲烷的產(chǎn)生，但因目前所納入的樣本量有限，無法得出準(zhǔn)確結(jié)論。本實驗將繼續(xù)進(jìn)行，并計劃利用16sRNA測序技術(shù)檢測早產(chǎn)兒出生后4周內(nèi)的腸道菌群，以驗證早產(chǎn)兒出生后4周內(nèi)腸道菌群中是否含有產(chǎn)甲烷菌，其腸道微生物是否可產(chǎn)生甲烷。

表5 早產(chǎn)兒不同日齡下各培養(yǎng)基內(nèi)氫氣所占比例分布表Tab 5 Distribution of methane in different media of preterm infants at different ages［%，M（P25，P75）］

表6 早產(chǎn)兒不同日齡下各培養(yǎng)基內(nèi)硫化氫所占比例分布表Tab 6 Distribution of hydrogen sulfide in different media of preterm infants at different ages ［%，M（P25，P75）］

圖5 各組硫化氫所占比例差異圖Fig 5 The proportion difference of hydrogen sulfide in each medium

氫氣是腸道菌群發(fā)酵的常見氣體產(chǎn)物，可通過3種方式消除：（1）通過屁從肛門排出；（2）吸收到系統(tǒng)循環(huán)和隨后的呼吸排泄；（3）通過結(jié)腸微生物代謝。目前認(rèn)為腸道微生物的消耗是消除氫氣的主要方式［20］，腸道氫氣可以被腸道產(chǎn)甲烷菌用作代謝燃料來生產(chǎn)甲烷，而被乙酰乙酸和硫酸鹽還原生物用作生產(chǎn)硫化氫［21］。本研究于早產(chǎn)兒出生后第2周方才檢測到數(shù)量較多的氫氣，而無論早產(chǎn)兒處于何種日齡，培養(yǎng)基LAT中產(chǎn)氫氣的量均最多，說明在早產(chǎn)兒食物中添加乳糖會使腸道產(chǎn)氫氣量增加。氫氣呼出實驗作為乳糖不耐受的診斷方法之一，診斷原理就是通過測定呼出的氫氣水平反映乳糖的消化吸收狀況［22］，顯然，這種方法并不適用于新生兒。本研究所采用的體外發(fā)酵模擬平臺及氣體檢測儀，也許可成為研究乳糖不耐受的新手段。

硫化氫是一種刺激性有毒氣體，在結(jié)腸中由內(nèi)源性和自然產(chǎn)生的硫酸鹽還原細(xì)菌產(chǎn)生，起著細(xì)胞保護(hù)和細(xì)胞毒性的作用［23-24］。越來越多的研究者提出硫化氫的產(chǎn)生增多與潰瘍性結(jié)腸炎也許存在關(guān)系，但目前尚無有力的證據(jù)［25-26］。本實驗結(jié)果顯示，早產(chǎn)兒出生后第2周可檢測到硫化氫，但并非所有的早產(chǎn)兒均可檢測到，且大部分早產(chǎn)兒產(chǎn)生量極少。有1例壞死性小腸結(jié)腸炎患兒被檢測到較多的硫化氫。硫化氫產(chǎn)生過多是否與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎之間存在一定的聯(lián)系，值得進(jìn)一步研究。

圖6 各組甲烷、二氧化碳、氫氣、硫化氫所占比例差異圖Fig 6 Proportion difference of carbon dioxide，methane，hydrogen and hydrogen sulfide in each medium

通過培養(yǎng)基LAT、FOS、FL-2、GOS組間的對比，我們發(fā)現(xiàn)：無論受試者處于何種日齡，培養(yǎng)基FL-2中產(chǎn)氣總量均最少，而培養(yǎng)基LAT中產(chǎn)氣總量最多；培養(yǎng)基FL-2中二氧化碳、氫氣、硫化氫所占比例較少，在培養(yǎng)基LAT中較多，說明適當(dāng)提高早產(chǎn)兒食物中母乳低聚糖的所占比例可減少早產(chǎn)兒腸道內(nèi)氣體的產(chǎn)生，減少腹脹的發(fā)生，部分解釋了母乳喂養(yǎng)的好處。相比之下，若受試者結(jié)腸部位存在大量的乳糖，腸道內(nèi)產(chǎn)氣將會增加，從而引發(fā)腹脹癥狀，與臨床上乳糖不耐受患兒常出現(xiàn)腹脹癥狀［27］的情況一致。同時，本實驗結(jié)果也許提示我們，乳糖不耐受患兒較正常新生兒腸道產(chǎn)氣中二氧化碳、氫氣、硫化氫的濃度明顯增高，而甲烷的濃度無明顯變化，此結(jié)論尚需大樣本實驗進(jìn)一步驗證。

與之前所報道的成年人經(jīng)肛門所排出氣體的主要的組份為氮?dú)猓?9%），氫氣（20.9%），二氧化碳（9%），甲烷（7.2%），氧 氣（3.9%）和 硫 化 氫（0.000 28%）不同，本實驗所測的早產(chǎn)兒腸道產(chǎn)氣各組成成分所占比例的遞減順序為：二氧化碳、氫氣、甲烷、硫化氫，由于技術(shù)限制，本實驗未檢測早產(chǎn)兒腸道產(chǎn)氣中氮?dú)?、氧氣所占比例，這是本實驗有待改進(jìn)之處。

本研究還存在以下不足之處：（1）納入的例數(shù)較少；（2）開展地點(diǎn)僅限上海市兒童醫(yī)院；（3）未能研究性別、產(chǎn)式、胎齡、喂養(yǎng)方式、生后Apgar評分、抗生素的使用等因素對早產(chǎn)兒腸道微生物產(chǎn)氣的影響；（4）未能進(jìn)行足月兒與早產(chǎn)兒腸道微生物產(chǎn)氣的差異研究等。因此，本研究所得結(jié)果只是腸道微生物產(chǎn)氣方面的初步探索，需增大樣本量進(jìn)一步研究。同時，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、新生兒乳糖不耐受、敗血癥等疾病是否會影響腸道微生物產(chǎn)氣，如果有影響，其差異是否具有特異性，這種差異是否有助于疾病的早期診斷等，均是今后研究方向。

作者貢獻(xiàn)聲明王雪芳實驗構(gòu)思與設(shè)計，數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析，繪制圖表，論文撰寫和修訂。李娟，李娜實驗構(gòu)思與設(shè)計，數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)整理與保存，論文修訂。尹迪，張華婷數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，論文修訂。朱立穎提供材料、樣品、試劑、案例。龔小慧論文修訂。胡勇可行性分析，監(jiān)督指導(dǎo)，獲取資助，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。