基于酯酶同工酶的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌遺傳多樣性分析*

高 鋒，何明霞，劉 靜，方藝偉，楊天偉，許欣景，王文兵，王 云，張春霞

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100）

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus portentosus） 是牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus） 的一種珍稀食用菌，俗稱黑牛肝菌，國內(nèi)主要分布于云南、廣西、海南和四川；國外主要分布于泰國和斯里蘭卡[1]。同時，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌是西雙版納市場上深受人們喜愛的一種有營養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)價值高，且味道鮮美的珍稀食用菌[2]。

野生暗褐網(wǎng)柄牛肝菌由于受到掠奪性地采收，市場供應(yīng)量逐年遞減。2003年以來系統(tǒng)地進(jìn)行了暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的栽培技術(shù)研究[2-4]，目前其人工栽培專利已成功轉(zhuǎn)讓給企業(yè)進(jìn)行工廠化周年栽培[5-7]；仿生栽培技術(shù)也相繼獲得成功[8-9]，并已向部分農(nóng)戶推廣。無論是工廠化栽培還是仿生栽培，目前所用的優(yōu)良菌株主要是通過組織分離野生及仿生栽培的子實(shí)體，再經(jīng)過出菇試驗(yàn)篩選獲得[10-11]。由于優(yōu)良菌株傳代一定次數(shù)后會發(fā)生退化[19]，因此科學(xué)有效地保護(hù)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌野生資源對該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

同工酶是催化相同反應(yīng)而結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的一類酶[12]，同工酶分析是從蛋白質(zhì)水平上研究生物群體遺傳分化的重要手段之一[12-14]。對酯酶同工酶酶譜的相似性系數(shù)進(jìn)行聚類分析已廣泛用于研究食用菌菌株的親緣關(guān)系和遺傳分化[15-16]，也用于選擇雜交親本、預(yù)測雜交優(yōu)勢[17]和鑒定雜交菌株[18]的研究。為了系統(tǒng)地評估暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的遺傳多樣性，從云南、四川兩省的9個采樣地共收集31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體并通過組織分離獲得了其菌株，分別利用固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2種方式獲得其菌絲體，并對其進(jìn)行酯酶同工酶分析，通過酶譜聚類分析研究分離菌株的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 子實(shí)體采集

野生子實(shí)體采集信息見表1，來源于同一采集地子實(shí)體的組織分離菌株為一個群體。

表1 子實(shí)體采集信息Tab.1 Information of sampled Phlebopus portentosus isolates

1.2 培養(yǎng)基

M1液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯（煮汁） 200 g、葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO41 g，蒸餾水定容至1 L[19]。

M1固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯（煮汁） 200 g、葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO41 g、瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L[19]。

1.3 試劑

Blue Plus?Protein Marker（1.4×104～1.0×105），北京全式金生物技術(shù)有限公司；Precast-Glgel 10%預(yù)制膠、改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒及其他分析純試劑，上海生工生物工程股份有限公司。

1.4 儀器

BIC-250人工氣候箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SK-100B恒溫?fù)u床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.5 菌株分離和保藏

選取新鮮、實(shí)心、菌管尚未開放的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體，切去菌柄底部的泥沙，在超凈工作臺上，挑取菌柄與菌蓋交界部位約0.5 cm×0.5 cm組織塊，置于試管中M1固體培養(yǎng)基斜面上，在28℃～30℃條件下避光培養(yǎng)30 d。切取約50 mm2菌絲塊，置于裝有5 m無菌蒸餾水的15 mL塑料管中，15℃避光保存于云南省熱帶作物科學(xué)研究所。

1.6 酯酶同工酶電泳

1.6.1 菌絲體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)菌絲體：挑取菌絲塊（直徑1 cm）接種于M1固體培養(yǎng)基平板上，于30℃避光培養(yǎng)7 d，在菌絲尖端切取1個菌絲塊（直徑1 cm） 接種于另一個平板中央，30℃避光培養(yǎng)18 d。

液體培養(yǎng)菌絲體：挑取菌絲塊（直徑1 cm） 接種于M1固體培養(yǎng)基平板上，于30℃避光培養(yǎng)7 d，無菌操作用手術(shù)刀將菌絲尖端挑取的10個菌絲塊（直徑1 cm） 切碎，轉(zhuǎn)至裝有400 mL M1液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。

1.6.2 酯酶同工酶電泳

樣品制備、電泳及染色分析參照高鋒等[19-20]的方法。根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的相對分子質(zhì)量及各條帶的相對遷移率，利用Microsoft Excel 2019擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，用AlphaView SA3.4.0軟件計(jì)算各菌株酯酶同工酶的相對遷移率及相對分子質(zhì)量。

1.7 聚類分析

為了分析菌株間的親緣關(guān)系，參照Sneath等[21]的方法計(jì)算相似性系數(shù)（S），公式為：

式中：a為A菌株條帶數(shù)；b為B菌株條帶數(shù)；c為A菌株、B菌株共有條帶數(shù)。

先用SPSS 20.0軟件中的Jaccard相似性計(jì)算出菌株間的酯酶同工酶酶譜相似性系數(shù)（S）矩陣，再將該矩陣換算為距離（D=1-S） 矩陣，最后用MEGA X軟件的類平均連鎖法（UPGMA） 對各菌株酯酶同工酶酶譜進(jìn)行聚類分析[22]。鑒于同一菌株2種培養(yǎng)方式的酯酶同工酶酶譜存在較大差異，單一培養(yǎng)方式有部分酯酶同工酶未誘導(dǎo)出，因此，將2種培養(yǎng)方式的酶譜合并后進(jìn)行聚類分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶電泳結(jié)果

部分液體及固體培養(yǎng)的菌絲體酯酶同工酶電泳圖見圖1、圖2。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌酯酶同工酶條帶統(tǒng)計(jì)見表2。

圖1 部分液體培養(yǎng)菌絲體酯酶同工酶電泳圖Fig.1 Electrophoretic zymogram of esterase isozymes of mycelia cultured in liquid medium

圖2 部分固體培養(yǎng)菌絲體酯酶同工酶電泳圖Fig.2 Electrophoretic zymogram of esterase isozymes of mycelia cultured on solid medium

如圖1、圖2所示，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株酯酶同工酶條帶類型有4種：深色寬、深色窄、淺色寬和淺色窄；根據(jù)蛋白Marker確定各條帶的相對分子質(zhì)量及相對遷移率，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.997）方程為：

式中：y為相對分子質(zhì)量；x為相對遷移率（Rf）。

如表2所示，31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株固體培養(yǎng)的菌絲體共檢出10條酯酶同工酶條帶，其中，Rf為 0.13、0.48、0.55和0.65的條帶出現(xiàn)頻率較高，各菌株分別具有2條～5條酯酶同工酶條帶，共檢出21種酶譜類型；液體培養(yǎng)的菌絲體共檢出11條酯酶同工酶條帶，Rf為0.13、0.55、0.38、0.65和0.75的條帶出現(xiàn)頻率較高，各菌株分別具有2條～6條酯酶同工酶條帶，共檢出23種酶譜類型。2種培養(yǎng)方式下所有菌株均檢出一條Rf為0.13、相對分子質(zhì)量為136 kDa的酯酶同工酶條帶。不同培養(yǎng)方式酯酶同工酶酶譜相似性系數(shù)見表3。

表3 不同培養(yǎng)方式酯酶同工酶酶譜相似性系數(shù)Tab.3 Similarity coefficient of esterase isozymes in different medium of the same strain

如表3所示，不同培養(yǎng)方式下，同一菌株的酶譜也存在不同程度的差異，相似性系數(shù)介于0.143～1.000，除了MHDL5、HHKY1和JHSC1的相似性系數(shù)大于等于0.500外，其他28個菌株的相似性系數(shù)均小于0.500。31個菌株中，液體培養(yǎng)菌株的酯酶同工酶條帶數(shù)與固體培養(yǎng)的比值大于1的菌株有19個，等于1的有8個，小于1的有4個，可見液體培養(yǎng)菌株的酯酶同工酶條帶數(shù)普遍多于固體培養(yǎng)。

2.2 酯酶同工酶酶譜聚類分析結(jié)果

2.2.1 液體培養(yǎng)菌株聚類分析結(jié)果

液體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果見圖3。

圖3 液體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of esterase isozyme zymogram of mycelia cultured in liquid medium

如圖3所示，31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株液體培養(yǎng)菌絲體的酶譜相似性系數(shù)為0.111～1.000，遺傳距離為0～0.889。31個菌株在遺傳距離為0.150、0.220和 0.290時，分別聚為 13（1～13） 類、7（a～g） 類和4（I～I(xiàn)V） 類。在遺傳距離為0.150時，除HHGJ、JHDF、MY群體的菌株分別聚在同一分支外，其他群體的菌株聚在不同分支。

2.2.2 固體培養(yǎng)菌株聚類分析結(jié)果

固體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果見圖4。

如圖4所示，31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株固體培養(yǎng)的菌絲體酶譜相似性系數(shù)為0.125～1.000，遺傳距離為0～0.875。31個菌株在遺傳距離為0.130、0.225和0.300時，分別聚為16（1～16）類、9（a～i）類和4（I～I(xiàn)V） 類。在遺傳距離為0.130時，只有MY群體的2個菌株聚在同一分支，其他群體的菌株聚在不同分支。

圖4 固體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果Fig.4 Cluster analysis of esterase isozyme zymogram of mycelia cultured on solid medium

2.2.3 兩種培養(yǎng)方式菌株聯(lián)合聚類分析結(jié)果

2種培養(yǎng)方式菌株酯酶同工酶酶譜聯(lián)合聚類結(jié)果見圖5。

如圖5所示，2種培養(yǎng)方式菌株的酶譜進(jìn)行聯(lián)合聚類分析的相似性系數(shù)為0.083～1.000，遺傳距離為0～0.917。31個菌株在遺傳距離為0.160、0.245和 0.280時，分別聚為 13（1～13） 類、7（a～g） 類和4（I～I(xiàn)V） 類。在遺傳距離為0.160時，只有MY群體的2個菌株聚在同一分支，其他群體的菌株聚在不同分支。

圖5 兩種培養(yǎng)方式菌株酯酶同工酶酶譜聯(lián)合聚類結(jié)果Fig.5 Combination cluster analysis of esterase isozyme zymogram of solid and liquid media cultured mycelium

3 討論

多項(xiàng)研究利用酯酶同工酶技術(shù)分析野生食用菌菌株的遺傳多樣性以及與地理分布的相關(guān)性。王一等[23]研究發(fā)現(xiàn)來源于川西高原的113個蘑菇（Agaricus campestris） 菌株在相似系數(shù)為0.50時，分為5大類群，但聚類結(jié)果與采集地的地理位置相關(guān)性不強(qiáng)。郭金英等[24]研究發(fā)現(xiàn)采自神農(nóng)架的40個野生香菇（Lentinula edodes） 菌株分別具有5條～8條酯酶同工酶條帶，在遺傳相似系數(shù)約0.71時，分為7個類群。翟玉[25]研究發(fā)現(xiàn)，除個別菌株外，采自云南省及周邊的黑木耳（Auricularia auricular）菌株與東北地區(qū)的菌株分別聚在不同的分支上。吳圣進(jìn)等[16]研究發(fā)現(xiàn)廣西百色地區(qū)采集的23個野生黑木耳菌株在遺傳相似系數(shù)為0.68時，分為兩大類群，大部分菌株聚類結(jié)果與地理位置相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)基于酯酶同工酶酶譜的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株聚類結(jié)果與地理來源無相關(guān)性，這與多年的生態(tài)調(diào)查相吻合。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌在國內(nèi)主要分布在公園、果園、苗圃中，在原始森林中極少發(fā)現(xiàn)，推測其可能隨著宿主植物的引種、移栽發(fā)生了人為傳播，因此各地域間的菌株未能形成有效的地理隔離。

研究表明，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件對食用菌酯酶同工酶的表達(dá)具有一定的影響。梁建光等[26]分別從培養(yǎng)第7天、第11天、第14天的糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 菌絲體中檢出10條、15條、13條酯酶同工酶條帶；在4種不同培養(yǎng)基（I～I(xiàn)V） 培養(yǎng)的菌絲體中分別檢出5條、6條、11條、3條酯酶同工酶條帶，其中培養(yǎng)基III與IV培養(yǎng)的菌絲體之間的酶譜相似性系數(shù)僅為0.273。吳康云等[27]從培養(yǎng)10 d的黑木耳單核菌株J3和H2中分別檢出3條、6條酯酶同工酶酶條帶，培養(yǎng)30 d時2個菌株均缺少Rf為0.673的條帶。李守勉等[28]發(fā)現(xiàn)刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）2號菌株在培養(yǎng)至第5天時具有Rf為0.200和0.345的2個酯酶同工酶條帶，第7天時增加Rf為0.455的條帶，9 d～15 d時增加Rf為0.873和0.945的2條條帶。宗立立等[29]從PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的滑菇（Pholiota nameko） C31菌株菌絲體中檢出8個酯酶同工酶條帶，而PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時只檢出7條，兩者相似性系數(shù)為0.875。本研究中菌絲體液體培養(yǎng)時間為7 d，固體培養(yǎng)時間為18 d，相同菌株不同培養(yǎng)方式的酶譜相似性系數(shù)均小于0.500，2種培養(yǎng)方式酶譜的聯(lián)合聚類分析結(jié)果表明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌具有豐富的遺傳多樣性。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛用于食用菌遺傳多樣性研究[30-32]，后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步增加暗褐網(wǎng)柄牛肝菌采集地?cái)?shù)量，盡可能覆蓋其主要分布區(qū)域并適當(dāng)增加分離菌株數(shù)，利用SSR、ISSR、RAPD、ITS等分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性，為后續(xù)種質(zhì)資源保護(hù)、種性鑒定、優(yōu)良菌株選育及菌種管理等提供參考。