芍藥苷通過(guò)調(diào)控硫氧還蛋白結(jié)合蛋白表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響

劉俊英，郭志玲

作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河南 洛陽(yáng)471003

免疫球蛋白A（IgA）腎病屬于原發(fā)性腎小球腎炎，而腎小球系膜細(xì)胞異常增生及系膜基質(zhì)增多是腎小球腎炎的主要病因。腎小球系膜細(xì)胞增殖與脂多糖（Lipopolysacharide，LPS）、炎性細(xì)胞因子等密切相關(guān)，其可促使多肽因子等致纖維化因子釋放而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成進(jìn)而引發(fā)腎小球腎炎。既往研究顯示腎小球系膜細(xì)胞過(guò)度凋亡也可促進(jìn)腎炎的發(fā)生。因而抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡對(duì)腎小球腎炎的治療具有重要意義。研究表明芍藥苷可減少活性氧（ROS）的含量從而減輕氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。芍藥苷可通過(guò)抗氧化作用減輕LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性炎癥腦損傷。但芍藥苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響尚未可知。研究表明硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）在高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，TXNIP 表達(dá)下調(diào)可減少ROS 的產(chǎn)生而增強(qiáng)抗氧化能力。本研究從2018年1月至2019年7月期間采用LPS 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞，探討芍藥苷對(duì)腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響，分析其對(duì)TXNIP的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芍藥苷購(gòu)自陜西百草萃生物；LPS 購(gòu)自美國(guó)Sigma；人腎小球系膜細(xì)胞HMCL 購(gòu)自湖南豐暉生物。丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷；超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-Caspase3）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；兔抗人TXNIP 多克隆抗體購(gòu)自上海生工生物；TXNIP 小干擾RNA（si-TXNIP）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1 購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Trziol、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1

藥物處理及實(shí)驗(yàn)分組 HMCL 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（Con 組）、LPS 組、LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組，其中Con 組細(xì)胞未經(jīng)LPS與芍藥苷處理，其余各組均使用濃度為10 nmol/L的LPS誘導(dǎo)細(xì)胞，芍藥苷不同劑量組分別加入終濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的芍藥苷處理細(xì)胞24 h。觀察芍藥苷對(duì)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，篩選適宜濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后續(xù)研究為驗(yàn)證芍藥苷與TXNIP的調(diào)控作用，將HMCL細(xì)胞隨機(jī)分為L(zhǎng)PS+si-NC 組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-NC 24 h，用含有10 nmol/L的LPS處理細(xì)胞24 h）、LPS+si-TXNIP組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-TXNIP 24 h，用含有10 nmol/L 的LPS 處理細(xì)胞24 h）、LPS+芍藥苷+pcDNA組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA 24 h，用含有10 nmol/L的LPS與20 μmol/L的芍藥苷共同處理24 h）、LPS+芍藥苷+pcDNA-TXNIP組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-TXNIP 24 h，用含有10 nmol/L 的LPS與20 μmol/L的芍藥苷共同處理24 h）。

1.2.2

檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px水平 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，采用水溶性四唑鹽法檢測(cè)SOD活性，二硫代二硝基甲苯酸法檢測(cè)GSH-px活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMCL 細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4

qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中TXNIP mRNA 表達(dá)水平 收集各組HMCL細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照熒光定量試劑盒且以cDNA 為模板配置qRT-PCR 反應(yīng)體系，qRT-PCR 反應(yīng)條件：94 ℃2 min（循環(huán)1 次），94 ℃20 s，58 ℃20 s，72 ℃20 s（循環(huán)40 次）。用美國(guó)ABI StepOnePlus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀計(jì)算TXNIP mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5

Western blotting 檢 測(cè)TXNIP、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3 蛋白表達(dá) 提取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMCL細(xì)胞總蛋白，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶500），4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（1∶1 000），室溫孵育1 h，ImageJ軟件對(duì)蛋白進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與Con 組相比，LPS 組腎小球系膜細(xì)胞中MDA 含量升高（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性降低（

P＜

0.05）；與LPS組相比，LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組腎小球系膜細(xì)胞中MDA 含量降低（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性升高（

P＜

0.05），見表1。

表1 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

2.2 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響

與Con 組比較，LPS 組腎小球系膜細(xì)胞凋亡率增加（

P＜

0.05），相較于LPS 組，LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組腎小球系膜細(xì)胞凋亡率降低（

P＜

0.05），見圖1、圖2、表2。

圖1 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

2.3 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP表達(dá)的影響

與Con組相比，LPS組腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP mRNA及蛋白表達(dá)量升高（

P＜

0.05）；相較于LPS組，LPS+芍藥苷-低組、LPS+芍藥苷-中組、LPS+芍藥苷-高組腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP mRNA及蛋白表達(dá)量降低（

P＜

0.05），見圖3、表3。

圖3 TXNIP蛋白表達(dá)

表3 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP表達(dá)的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

2.4 干擾TXNIP 表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

與LPS+si-NC 組相比，LPS+si-TXNIP 組腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP 的表達(dá)量降低，MDA 含量減低，SOD、GSH-Px 活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，Bax蛋白表達(dá)量降低（均

P＜

0.05），見圖4、表4。

圖4 干擾TXNIP表達(dá)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

表4 干擾TXNIP表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

2.5 TXNIP 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了芍藥苷（20

μ

mol/L）對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用

與LPS+芍藥苷+pcDNA 組相比，LPS+芍藥苷+pcDNA-TXNIP 組腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP 蛋白表達(dá)量升高（

P＜

0.05），MDA 含量升高（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性降低（

P＜

0.05），細(xì)胞凋亡率升高（

P

＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（

P＜

0.05），Bax 蛋白表達(dá)量升高（

P＜

0.05），見圖5、表5。

圖5 TXNIP過(guò)表達(dá)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 TXNIP過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

3 討論

腎小球腎炎可引起慢性腎功能衰竭，若腎小球炎癥、氧化應(yīng)激及損傷等過(guò)程中腎小球系膜細(xì)胞過(guò)度增殖可增加炎性細(xì)胞因子的釋放量最終引發(fā)腎小球硬化。研究表明LPS具有趨化細(xì)胞的作用并可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖。因此本研究主要采用LPS處理腎小球系膜細(xì)胞，探討芍藥苷對(duì)腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響及其作用機(jī)制。

芍藥苷可通過(guò)降低ROS水平而改善LPS誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。研究表明芍藥苷可能通過(guò)下調(diào)ABCA1 表達(dá)而抑制LPS 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞炎癥因子分泌及釋放。相關(guān)報(bào)道指出芍藥苷可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞HMCL 中MDA 含量升高，而SOD、GSH-Px 活性降低，提示LPS 誘導(dǎo)的HMCL 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。研究表明氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MDA 生成量增加可加重氧化應(yīng)激損傷，SOD、GSH-Px 屬于抗氧化酶類，提高SOD、GSH-Px 活性可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示不同濃度的芍藥苷均可降低LPS誘導(dǎo)的HMCL 細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 生成，增加內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性而抑制LPS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷從而發(fā)揮保護(hù)作用。研究報(bào)道指出細(xì)胞凋亡在腎病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，高糖可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中Bax、cleaved-caspase3 的表達(dá)及抑制Bcl-2 的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而加重疾病嚴(yán)重程度。與上述研究報(bào)道相似，本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的HMCL細(xì)胞中Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低，細(xì)胞凋亡率升高，說(shuō)明LPS 可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，不同濃度的芍藥苷處理后可抑制細(xì)胞凋亡及Bax、cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，提示芍藥苷可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡。

TXNIP可通過(guò)與硫氧還蛋白結(jié)合而抑制其抗氧化作用，并可促進(jìn)ROS 生成引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，研究表明TXNIP 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病腎病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明人腎小管上皮細(xì)胞高糖缺氧復(fù)氧損傷中TXNIP 表達(dá)升高，抑制TXNIP的表達(dá)可減緩高糖缺氧復(fù)氧損傷。相關(guān)報(bào)道指出抑制TXNIP/NLRP3 信號(hào)通路可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷而減輕腎臟損傷。與上述報(bào)道結(jié)果顯示，本研究結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)的HMCL 細(xì)胞中TXNIP 的表達(dá)水平升高，不同濃度的芍藥苷可降低TXNIP的表達(dá)，且隨著芍藥苷濃度的增加而降低，提示芍藥苷可抑制LPS誘導(dǎo)的HMCL 細(xì)胞中TXNIP 的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)干擾TXNIP 的表達(dá)可降低HMCL細(xì)胞凋亡率，提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，并可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，而抑制Bax的表達(dá)，提示干擾TXNIP 的表達(dá)可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷從而對(duì)LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用。本研究進(jìn)一步分析顯示TXNIP過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)芍藥苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激與凋亡的作用，提示芍藥苷可通過(guò)抑制TXNIP的表達(dá)而拮抗氧化應(yīng)激對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的損傷從而發(fā)揮保護(hù)腎臟作用。

綜上所述，芍藥苷可通過(guò)抑制TXNIP 的表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，可能作為保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞的新型藥物，有望為腎小球硬化、腎小球腎炎等腎臟疾病的臨床治療提供新方向。