TLR4∕NF-κB信號通路在脊髓損傷中的作用△

王慶鋒，梁學(xué)剛，劉學(xué)起

（寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，寧夏銀川750004）

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）是指脊髓受到外力的撞擊后導(dǎo)致的完全性或不完全性脊髓損傷平面下的運動、感覺等功能障礙，是脊柱損傷中嚴重的并發(fā)癥［1-3］，多發(fā)于20～40歲中青年人群。調(diào)查結(jié)果顯示脊髓損傷發(fā)病率為 6.7∕100 萬人口［4，5］。到目前為止，脊髓損傷的機制仍不完全明確，其治療和預(yù)后仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。

脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩種損傷機制，繼發(fā)性損傷存在大量的炎性破壞過程，對機體的損害遠大于原發(fā)性損傷［6-8］。炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的主要成分，在急性SCI的病理生理學(xué)機制中處于核心地位［9，10］。直接抑制 NF-κB 的激活可以在 SCI后減少這些炎癥相關(guān)基因的表達，減輕炎癥反應(yīng)，改善功能恢復(fù)［11］， 因此 TLR4∕NF-κB 信號通路可能成為治療繼發(fā)性SCI新的作用靶點。

單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯（monosialoganglioside,GM1）是繼甲基強的松龍之后臨床上治療脊髓損傷的常用藥物［12-14］。目前對于GM1治療SCI的具體機制目前依然不十分明確。因此，本研究采用改良Allen法建立大鼠中度脊髓損傷模型進行相關(guān)研究，觀察TLR4∕NF-κB信號通路在SCI發(fā)病中的作用及GM1治療SCI的相關(guān)機制，以期為SCI的發(fā)病及治療提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

60只清潔級成年SD大鼠，體重 （200.34±25.43）g，10～12周齡。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 25°C，相對濕度40%～70%，每天接受自然光照9 h，自由進食飲水。隨機分為3組，每組20只，分別為假手術(shù)組、損傷組、GM1組。整個動物實驗過程嚴格遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》執(zhí)行。

1.2 建模手術(shù)

對損傷組和GM1組動物采用改良Allen法建立脊髓損傷模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉之后，以T12棘突為切入口，暴露出棘突，用10 g重錘從高處落下?lián)舸蚣顾?，造成脊髓損傷。當(dāng)大鼠出現(xiàn)擺尾、軀體抽搐的行為表示建模成功。假手術(shù)組僅行手術(shù)顯露，未行重錘擊打脊髓。

1.3 藥物處理與取材

GM1組于改良Allen法建立脊髓損傷模型后即給予GM1 l0 mg∕kg∕d經(jīng)尾靜脈注射，持續(xù)14 d。假手術(shù)組和損傷組于手術(shù)后尾靜脈注射等量生理鹽水，持續(xù)14 d。術(shù)后2 d分籠單獨飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)籠內(nèi)木屑干燥，提供充足的飲水及飼料，人工下腹部擠壓排尿2～3次，用電吹風(fēng)吹干被尿液浸濕的皮毛。

術(shù)后15 d，過量麻醉死動物，取出T12段脊髓，稱重，加入Trizol液，制備組織均漿，進行以下檢測。

1.4 RT-qPCR檢測

采用Trizol試劑（Life Technologies,USA）從組織勻漿中分離得到細胞內(nèi)總RNA。RNA的合成是利用cDNA使用iScript互補脫氧核糖核酸合成裝備（美國 Bio-Rad）。采用SYBR Green PCR master mix（Applied Biosystems,USA）在 ABI 7500 RT-qPCR系統(tǒng)上進行檢測，以確定目標基因的表達。目標基因的表達使用2-ΔΔGAPDH Ct方法量化和規(guī)范化。qP?CR 引物如下：TLR4-F：TGCCTTCACTA?CAGGGACTTT； TLR4-R： TGGGACACCACGA?CAATAAC； MyD88-F： CCTTGAACTCGGTTCT?CAATTCC； MyD88-R： CAATGGTCTGGTACT?TATTCCCG；NF-κB-F：ATAGCACCTTGGATGGG?TATTCC； NF-κB-R： CTGATGACCGGAGACAAA?CAG； TNF- α-F： ATTCTTGGTGGTCGCTAGGTA；TNF-α-R： CGCCTTCTCCGATGTACTGC；IL-6-F：TCGATACCCGATCTGGTCCTG；IL-6-R：TGCACTC?GATGTCCTCGCATC；GAPDH-F：TTGGCCAACTCG?GTTCTCATGAC；GAPDH-R：TCTCGGTCTGGTACT?TAGCTG。

1.5 Western-blot檢測

對組織勻漿使用RIPA裂解液抽提蛋白，8% SDS-PAGE電泳 2.5～3 h，電轉(zhuǎn)條件為先 80 V 30 min，后120 V 90 min。然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)條件為70 mA，90 min。用5%脫脂牛奶封閉2 h后，用一抗4℃孵育過夜，PBST洗三次，每次5 min去除一抗。用HRP標記的二抗室溫孵育60min，PBST洗三次，每次5 min去除二抗。PVDF膜在ECL化學(xué)發(fā)光劑工作濃度下孵育1～3 min，暗室壓片、曝光、固定及掃描，保存結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件（IBM,Armonk,NY,USA） 和 GraphPad Prism 5.0軟件 （GraphPad software,Inc.,La Jolla,CA,USA）。計量數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett's post-hoc檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷后TLR4∕NF-κB信號通路相關(guān)因子表達

RT-qPCR檢測TLR4∕NF-κB信號通路相關(guān)基因表達的結(jié)果見表1，與假手術(shù)組相比，損傷組的TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表達顯著增加，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 q-PCR檢測TLR4∕NF-κB相關(guān)基因mRNA表達結(jié)果（±s）與比較

表1 q-PCR檢測TLR4∕NF-κB相關(guān)基因mRNA表達結(jié)果（±s）與比較

指標T L R 4 M y D 8 8 N F-k b損傷組（n=1 0）3.3 2±0.1 1 2.8 7±0.2 1 2.5 3±0.2 3假手術(shù)組（n=1 0）1.0 0±0.0 1 1.0 0±0.0 2 1.0 0±0.0 4 P值0.0 2 1 0.0 2 6 0.0 3 4

Western-blot檢測 TLR4∕NF-κB 信號通路相關(guān)因子蛋白表達結(jié)果見圖1，與假手術(shù)組相比，損傷組的TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表達顯著增加，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Western-blot檢測TLR4∕NF-κB相關(guān)基因蛋白表達

2.2 脊髓損傷后相關(guān)炎性因子表達

RT-qPCR檢測炎性因子相關(guān)基因mRNA表達的結(jié)果見表2，與假手術(shù)組相比，損傷組的TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白MCP-1 mRNA表達顯著增加，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 q-PCR檢測炎性因子相關(guān)基因mRNA表達結(jié)果 （±s） 與比較

表2 q-PCR檢測炎性因子相關(guān)基因mRNA表達結(jié)果 （±s） 與比較

指標T N F-α I L-6 I L-1 β M C P-1損傷組（n=1 0）2.3 2±0.1 3 2.2 7±0.3 1 2.6 4±0.2 4 2.4 7±0.2 5假手術(shù)組（n=1 0）1.0 0±0.0 7 1.0 0±0.0 2 1.0 0±0.0 7 1.0 0±0.1 1 P值0.0 2 5 0.0 3 3 0.0 4 3 0.0 4 1

Western-blot檢測炎性因子相關(guān)基因蛋白表達結(jié)果見圖2，與假手術(shù)組相比，損傷組的TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞MCP-1蛋白表達顯著增加，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 Western-blot檢測相關(guān)炎性因子蛋白表達

2.3GM1對脊髓損傷TLR4∕NF-κB信號通路表達的影響

RT-qPCR檢測GM1對脊髓損傷后TLR4∕NF-κB信號通路相關(guān)基因mRNA表達影響的結(jié)果見表3，與假手術(shù)組相比，損傷組的TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達顯著增加（P＜0.05），而GM1干預(yù)又能顯著抑制這些基因的表達，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 RT-qPCR檢測TLR4∕NF-κB信號通路基因mRNA表達結(jié)果（±s）與比較

表3 RT-qPCR檢測TLR4∕NF-κB信號通路基因mRNA表達結(jié)果（±s）與比較

指標T L R 4 M y D 8 8 N F-κ B干預(yù)組1.1 2±0.0 1 1.1 7±0.0 3 1.1 3±0.0 3損傷組（n=1 0）3.3 2±0.1 1 2.8 7±0.2 1 2.5 3±0.2 3假手術(shù)組（n=1 0）1.0 0±0.0 1 1.0 0±0.0 2 1.0 0±0.0 4 P值0.0 1 1 0.0 1 3 0.0 2 1

Western-blot檢測GM1對脊髓損傷后TLR4∕NF-κB信號通路相關(guān)基因蛋白表達影響結(jié)果見圖3，與假手術(shù)組相比，損傷組的TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達顯著增加（P＜0.05），而GM1干預(yù)又能顯著抑制這些基因蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Western-blot檢測GM1干預(yù)后TLR4∕NF-κB信號通路相關(guān)基因蛋白表達

2.4 GM1對脊髓損傷中相關(guān)炎性因子表達的影響

RT-qPCR檢測GM1對脊髓損傷后炎性因子相關(guān)基因mRNA表達影響的結(jié)果見表4，與假手術(shù)組相比，損傷組的TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白 MCP-1 mRNA表達顯著增加（P＜0.05），而GM1干預(yù)又能顯著抑制這些基因的mRNA表達，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Western-blot檢測GM1對脊髓損傷后炎性因子相關(guān)基因蛋白表達影響結(jié)果見圖4，與假手術(shù)組相比，損傷組的TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1蛋白表達顯著增加（P＜0.05），而GM1干預(yù)又能顯著抑制這些基因蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 q-PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達結(jié)果 （±s） 與比較

表4 q-PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達結(jié)果 （±s） 與比較

指標T N F-α I L-6 I L-1 β M C P-1干預(yù)組1.2 2±0.0 1 1.1 6±0.0 3 1.2 3±0.0 3 1.1 3±0.0 3損傷組（n=1 0）2.2 3±0.1 3 2.3 7±0.3 1 2.5 4±0.2 4 2.4 6±0.2 5假手術(shù)組（n=1 0）1.0 0±0.0 6 1.0 0±0.0 4 1.0 0±0.0 6 1.0 0±0.1 0 P值0.0 1 5 0.0 2 1 0.0 3 4 0.0 1 4

圖4 Western-blot檢測GM1干預(yù)后脊髓損傷中相關(guān)炎性因子蛋白表達

3 討論

SCI是脊柱損傷中嚴重的并發(fā)癥，也是目前外傷后致殘、致死率最高的疾病之一。隨著經(jīng)濟水平的發(fā)展，我國脊髓損傷發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高趨勢。脊髓損傷的治療及預(yù)后問題一直是目前醫(yī)學(xué)的難題之一，也是目前研究的熱點之一。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4∕NF-κB信號通路可能與繼發(fā)性SCI的發(fā)病具有密切的相關(guān)性，同時GM1可能影響TLR4∕NF-κB信號通路而對SCI具有治療作用，但是上述理論目前并不十分完善，迫切需要臨床研究進行證實。

本研究采用改良Allen法建立大鼠中度脊髓損傷模型，研究TLR4∕NF-κB信號通路在脊髓損傷中的作用機制。脊髓損傷后TLR4、MyD88和NF-κB mRNA和蛋白的表達顯著增加，這表明大鼠脊髓損傷后TLRs∕MyD88∕NF-κB 信號通路被異常激活。

NF-κB家族是炎癥基因表達的主要調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中調(diào)節(jié)許多細胞因子的表達，調(diào)控炎癥反應(yīng)［15］。在挫傷性SCI中發(fā)現(xiàn)了大量由NF-κB調(diào)控的基因表達，包括促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白 MCP-1等［16～17］。直接抑制 NF-κB 的激活可以在 SCI后減少這些炎癥相關(guān)基因的表達，減輕炎癥反應(yīng)，改善功能恢復(fù)［18］。因此，本研究分析了大鼠脊髓損傷后相關(guān)炎性因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白MCP-1 mRNA和蛋白的表達顯著增加，表明大鼠脊髓損傷后出現(xiàn)了嚴重的炎性反應(yīng)，這個過程依賴于 TLRs∕MyD88∕NF-κB信號通路。

目前研究認為，細胞膜上GM1的變化對調(diào)節(jié)神經(jīng)元和細胞內(nèi)外信息傳遞有重要意義，但是對于GM1治療SCI的具體機制依然不十分明確。近年來多個研究證實GM1治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以有效的降低患者的炎癥因子反應(yīng)水平［1,13］，特別是有研究證實GM1可以降低體外循環(huán)大鼠血清中的NF-κB水平［19］，因此本研究推測 GM1 通過影響 TLR4∕NF-κB信號通路來發(fā)揮治療SCI的作用。本研究通過尾靜脈注射 GM1，探討 GM1干預(yù)對脊髓損傷后TLRs∕MyD88∕NF-κB信號通路的及相關(guān)炎性因子表達的影響。結(jié)果表明GM1干預(yù)能夠顯著抑制脊髓損傷后TLR4、MyD88和NF-κB mRNA和蛋白的表達，這表明GM1干預(yù)能夠顯著抑制大鼠脊髓損傷后TLRs∕MyD88∕NF-κB信號通路的激活。此外，GM1能夠抑制脊髓損傷后TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白MCP-1 mRNA和蛋白的表達，這表明大鼠脊髓損傷后出現(xiàn)了嚴重的炎性反應(yīng)，而GM1能夠抑制TLRs∕MyD88∕NF-κB 信號通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

綜上所述，TLR4∕NF-κB信號通路可能成為治療繼發(fā)性SCI新的作用靶點。而GM1可能通過抑制TLR4∕NF-κB信號通路起到治療SCI的作用。